康育光　秦卓

摘 要：對山西省蔬菜斑潛蠅的發(fā)生進行了調(diào)查，并通過對線粒體DNA（mtDNA）的 COI 基因序列的擴增與測序，運用最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)樹，對斑潛蠅屬的3個種18個樣本進行了快速鑒定。此方法為快速準確地鑒定提供了一個新的參考途徑。

關鍵詞： 斑潛蠅；系統(tǒng)樹；快速鑒定

中圖分類號：Q969.44 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.022

Survey on Liriomyza in Shanxi and Its Rapid Identification

KANG Yu-guang，QIN Zhuo

（Shuozhou Vocational Technology School， Shuozhou， Shanxi 036002， China）

Abstract： The distribution of Liriomyza in Shanxi was investigated， and 18 samples of 3 species in the genus Liriomyza had been sequenced to obtain the data of mtDNA COI sequences for its identities. Combining both our data and those from Genbank， phylogenetic trees with most parsimony were constructed. The method is helpful for rapid identification.

Key words：Liriomyza； phylogenetic trees；rapid identification

斑潛蠅屬潛蠅科（Agromyzidae），斑潛蠅屬（Liriomyza） ，全世界已知300多種，主要分布于溫帶地區(qū)。絕大多數(shù)種類以潛葉方式取食危害植物，其中具有重要經(jīng)濟意義的種類是多食性種類，有10余種，但危害嚴重的有4種[1-3]，分別為：美洲斑潛蠅（Liriomyza sativae Blanchard）、南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis Blanchard）、三葉草斑潛蠅（Liriomyza trifolii Burgess）和番茄斑潛蠅（Liriomyza bryoniae Kaltenbach）。其寄主范圍可達14～29科的上百種植物[4-6]，是世界上許多國家和地區(qū)蔬菜、瓜類、花卉、煙草及某些中藥材的重要害蟲，有些種類是世界公認的檢疫害蟲[5，7]。

1 材料和方法

1.1 材 料

在山西省太原、臨汾、五臺山的菜田，對14種寄主植物進行調(diào)查。從田間采回帶有潛葉蠅幼蟲或蛹的寄主葉片，將其放入一次性塑料杯中，用紙巾將口封住并用橡皮筋扎緊，置于室內(nèi)養(yǎng)蟲箱中飼養(yǎng)，溫度控制在（25±1） ℃之間，相對濕度在60%～80%之間，讓其化蛹、羽化。待羽化24 h后，用細毛筆蘸100%的酒精，將已羽化的潛蠅成蟲收集到IMEC管中，并用100%的酒精浸泡，放置于-20 ℃的冰柜中保存，待用。

1.2 鑒定方法

1.2.1 形態(tài)鑒定 將浸泡在100%酒精中的樣本取出，根據(jù)成蟲形態(tài)特征（中鬃排列行數(shù)、前翅翅脈形狀、體長、體型、體色）、取食習性和幼蟲體色、后氣門突開口數(shù)、化蛹部位、化蛹方式、蛹的顏色等來判定。

1.2.2 快速鑒定 利用通用引物C1-J-1535（5-ATT GGA ACT TTA TAT TTT ATA TTT GG-3）和TL2-N-3014（3-TCC ATT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A-5）對線粒體COI基因進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物純化并測序，最后對測序結(jié)果進行校對和拼接，利用網(wǎng)絡同源序列搜索引擎BLAST對GenBank中的同源序列進行比較，通過該基因片段確定所屬種類。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中的物種鑒別特別重視形態(tài)學與DNA信息的結(jié)合。鑒別包括了可驗證的下列步驟：（1）初步鑒別到物種，并選定測序樣本；（2）在不告知物種信息的前提下測序，并將序列與公共數(shù)據(jù)庫進行比較，找到該序列最近的類群；（3）分類學家和分析人員對結(jié)果進行比較、相互驗證；（4）得出最終的分類鑒別結(jié)論。

DNA分類學的基本流程如下：從所獲取的個體上得到組織樣品，然后進行DNA提??；將得到的DNA作為后續(xù)研究的樣品，通過擴增，得到用于基因測序的一個或數(shù)個基因片段；而結(jié)果得到的基因序列將成為最初的一個鑒定標記，用于判斷樣品所取個體的物種屬性。這樣的序列將被整合到合適的數(shù)據(jù)庫中。序列和標本及相應的DNA作為以后工作的參考標準，會被儲藏到標本館（或博物館）中。一旦一個重要序列的數(shù)據(jù)庫構(gòu)建完成，新的樣品將會與現(xiàn)存序列進行比對從而完成物種的再次鑒定或判斷一個新的物種描述是否合理。數(shù)據(jù)庫還可以用來解決一些問題。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)生調(diào)查

通過在山西省太原、臨汾、五臺山等地的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在山西蔬菜田主要有3種斑潛蠅，它們分別是：美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard、南美斑潛蠅Liriomyza huidobrensis（Blanchard）、蔥斑潛蠅Liriaimyza chinensis（Kato）。其中前2種斑潛蠅是從國外陸續(xù)傳入我國并在蔬菜上危害的，蔥斑潛蠅主要分布在亞洲。在山西省多數(shù)蔬菜上發(fā)生且危害較重的是美洲斑潛蠅。

2.2 斑潛蠅快速鑒定

從圖1中可以看出，供試的樣本中一共有2種斑潛蠅，分別是美洲斑潛蠅Liriomyza sativae、南美班潛蠅 L. huidobrensis。在分子鑒別之后，又對這些樣本進行了形態(tài)學的鑒定，并對這兩個結(jié)果進行了對比。除樣本ZHY113和ZHY135外，其余樣本的分子鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果相吻合，但是樣本ZHY113和ZHY135的結(jié)果卻不一致，從圖1中可以看出，樣本ZHY113和ZHY135分別是南美班潛蠅和美洲斑潛蠅，而形態(tài)學鑒定的結(jié)果卻說明這兩個樣本都是蔥斑潛蠅。endprint

3 結(jié)論與討論

斑潛蠅中的部分種類屬于世界范圍內(nèi)的檢疫性害蟲，如美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅等，它們?nèi)菀纂S著寄主植物及其包裝鋪墊物等進行遠距離傳播擴散，所以當在某一地區(qū)發(fā)現(xiàn)時，需要在短時間內(nèi)對其進行快速、準確鑒定并加以控制。但該屬中有部分種類在形態(tài)上極為相似，即使專業(yè)分類學家在進行鑒定時也有一定困難。而如果不能進行快速和準確的鑒定，就會錯過防治的最好時機，也會給防治工作帶來困難，甚至造成防治的失誤，帶來一定的經(jīng)濟損失。

DNA分類學可在一定程度上解決這一難題。傳統(tǒng)分類學家在鑒別物種時通常使用多個形態(tài)學性狀，并且越來越多的學者還輔以來自DNA等其他方面的信息，來提高鑒別體系的可靠性；相反，DNA條形碼技術則以一個600 bp左右的線粒體DNA片段來建立鑒別體系[8]。DNA條形碼技術準確鑒別程度可以達到98%～100%，并成功應用到北美的鳥類[9]、澳大利亞的魚類[10]、亞熱帶的鱗翅目[11]，幫助分類學家鑒別出了隱存種，并逐漸在傳統(tǒng)分類學、系統(tǒng)發(fā)育與種群遺傳學中發(fā)揮著作用[12]。與傳統(tǒng)的分類方法相比，DNA分類具有快速、準確、實驗材料廣泛（成蟲、蛹、幼蟲或殘缺的標本）等特點，在沒有專業(yè)分類學家在場的情況下也可對樣品進行較為準確的鑒定。然而，我們也注意到該技術的缺陷：線粒體基因為母系遺傳，某些因素如Wolbachia，可能導致這些基因在不同生物物種之間的轉(zhuǎn)移，從而導致根據(jù)線粒體基因片段建立的物種鑒別體系不能反映真正自然的物種之間的關系[13]。而且，小范圍地區(qū)或有限的取樣可能導致錯誤估計物種之間的變異[8， 14]。所以，在設計準確鑒別體系的方案時，必須考慮取樣的大小，并同時考慮線粒體DNA和核糖體DNA。

但DNA分類也存在著一些問題。首先，DNA分類還并非是一種低成本的技術，它可能會將一些在資金和技術上存在困難的分類學家排斥在外[15]；其次，選擇哪一段序列用于分析，目前還未達成共識；而對這些序列的比對也將面臨多方面的困難[16]。如果種類的親緣關系過近，任何基因都可能變得無用[17]。且從不同的基因組（核基因組或細胞器基因組）中選取的序列可能會得出不同的分類結(jié)果[18]。

參考文獻：

[1] 陳乃中.蔬菜斑潛蠅的傳播與防治[J].植物檢疫，1995，9（1）：6-9.

[2] 唐志.美洲斑潛蠅的傳播蔓延[J].植物檢疫，1989，3（5）：348-350.

[3] Desming J C. Liriomyzasativae Blanchard established in theold world [J]. Trop Pest Management，1992，38（2）：218-219.

[4] 楊龍龍.對斑潛蠅屬中檢疫性害蟲的研究[J].植物檢疫，1995，9（1）：1-5.

[5] 康樂.斑潛蠅的生態(tài)學與持續(xù)控制[M].北京：科學出版社，1996：1-358.

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[7] 吳佳教.美洲斑潛蠅種群動態(tài)及控制研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學， 1997.

[8] Dasmahapatra K K， Mallet J. DNA barcodes： recent successes and future prospects[J]. Heredity， 2006， 97：254-255.

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[10] Ward R D， Zemlak T S， Innes B H， et al. DNA barcoding Australia's fish species[J]. Philosoph Trans R Soc B-BiolSci，2005， 360： 1847-1857.

[11] Hajibabaei M， Janzen D H， Burns J M， et al. DNA barcoding distinguishes species of tropical Lepidoptera[J]. PNAS， 2006， 103（4）：968-971.

[12] Hajibabaei M， Singer G A， Hebert PDN， et al. DNA barcoding： how it complements taxonomy， molecular phylogenetics and population genetics[J]. Trends in Genetics， 2007，23（4）：167-172.

[13] Hurst G D D， Jiggins F M. Problems with mitochondrial DNA as a marker in population， phylogeographic and phylogenetic studies： the effects of inherited symbionts[J]. Proc R Soc London Ser B-BiolSci， 2005， 272： 1 525-1 534.

[14] Meyer C P， Paulay G. DNA barcoding： error rates based on comprehensive sampling[J]. PLoS Biology，2005， 3 （12）： 422 .

[15] Seberg O， Humphries C J， Knapp S， et al. Shortcuts in systematics： A commentary on DNA-based taxonomy[J]. Trends EcolEvol， 2003， 18（2）： 63-65.

[16] Lipscomb D， Platnick N， Wheeler Q. The intellectual content of taxonomy： a comment on DNA taxonomy[J]. Trends EcolEvol， 2003， 18（2）： 65-66.

[17] Mallet J， Willmott K. Taxonomy： renaissance or tower of babel[J] . Trends EcolEvol， 2003， 18 （2）：57-59.

[18] Tautz. A plea for DNA taxonomy[J]. Trends in Ecology and Evolution， 2003， 18： 70-74.endprint

3 結(jié)論與討論

斑潛蠅中的部分種類屬于世界范圍內(nèi)的檢疫性害蟲，如美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅等，它們?nèi)菀纂S著寄主植物及其包裝鋪墊物等進行遠距離傳播擴散，所以當在某一地區(qū)發(fā)現(xiàn)時，需要在短時間內(nèi)對其進行快速、準確鑒定并加以控制。但該屬中有部分種類在形態(tài)上極為相似，即使專業(yè)分類學家在進行鑒定時也有一定困難。而如果不能進行快速和準確的鑒定，就會錯過防治的最好時機，也會給防治工作帶來困難，甚至造成防治的失誤，帶來一定的經(jīng)濟損失。

DNA分類學可在一定程度上解決這一難題。傳統(tǒng)分類學家在鑒別物種時通常使用多個形態(tài)學性狀，并且越來越多的學者還輔以來自DNA等其他方面的信息，來提高鑒別體系的可靠性；相反，DNA條形碼技術則以一個600 bp左右的線粒體DNA片段來建立鑒別體系[8]。DNA條形碼技術準確鑒別程度可以達到98%～100%，并成功應用到北美的鳥類[9]、澳大利亞的魚類[10]、亞熱帶的鱗翅目[11]，幫助分類學家鑒別出了隱存種，并逐漸在傳統(tǒng)分類學、系統(tǒng)發(fā)育與種群遺傳學中發(fā)揮著作用[12]。與傳統(tǒng)的分類方法相比，DNA分類具有快速、準確、實驗材料廣泛（成蟲、蛹、幼蟲或殘缺的標本）等特點，在沒有專業(yè)分類學家在場的情況下也可對樣品進行較為準確的鑒定。然而，我們也注意到該技術的缺陷：線粒體基因為母系遺傳，某些因素如Wolbachia，可能導致這些基因在不同生物物種之間的轉(zhuǎn)移，從而導致根據(jù)線粒體基因片段建立的物種鑒別體系不能反映真正自然的物種之間的關系[13]。而且，小范圍地區(qū)或有限的取樣可能導致錯誤估計物種之間的變異[8， 14]。所以，在設計準確鑒別體系的方案時，必須考慮取樣的大小，并同時考慮線粒體DNA和核糖體DNA。

但DNA分類也存在著一些問題。首先，DNA分類還并非是一種低成本的技術，它可能會將一些在資金和技術上存在困難的分類學家排斥在外[15]；其次，選擇哪一段序列用于分析，目前還未達成共識；而對這些序列的比對也將面臨多方面的困難[16]。如果種類的親緣關系過近，任何基因都可能變得無用[17]。且從不同的基因組（核基因組或細胞器基因組）中選取的序列可能會得出不同的分類結(jié)果[18]。

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斑潛蠅中的部分種類屬于世界范圍內(nèi)的檢疫性害蟲，如美洲斑潛蠅、南美斑潛蠅、三葉草斑潛蠅等，它們?nèi)菀纂S著寄主植物及其包裝鋪墊物等進行遠距離傳播擴散，所以當在某一地區(qū)發(fā)現(xiàn)時，需要在短時間內(nèi)對其進行快速、準確鑒定并加以控制。但該屬中有部分種類在形態(tài)上極為相似，即使專業(yè)分類學家在進行鑒定時也有一定困難。而如果不能進行快速和準確的鑒定，就會錯過防治的最好時機，也會給防治工作帶來困難，甚至造成防治的失誤，帶來一定的經(jīng)濟損失。

DNA分類學可在一定程度上解決這一難題。傳統(tǒng)分類學家在鑒別物種時通常使用多個形態(tài)學性狀，并且越來越多的學者還輔以來自DNA等其他方面的信息，來提高鑒別體系的可靠性；相反，DNA條形碼技術則以一個600 bp左右的線粒體DNA片段來建立鑒別體系[8]。DNA條形碼技術準確鑒別程度可以達到98%～100%，并成功應用到北美的鳥類[9]、澳大利亞的魚類[10]、亞熱帶的鱗翅目[11]，幫助分類學家鑒別出了隱存種，并逐漸在傳統(tǒng)分類學、系統(tǒng)發(fā)育與種群遺傳學中發(fā)揮著作用[12]。與傳統(tǒng)的分類方法相比，DNA分類具有快速、準確、實驗材料廣泛（成蟲、蛹、幼蟲或殘缺的標本）等特點，在沒有專業(yè)分類學家在場的情況下也可對樣品進行較為準確的鑒定。然而，我們也注意到該技術的缺陷：線粒體基因為母系遺傳，某些因素如Wolbachia，可能導致這些基因在不同生物物種之間的轉(zhuǎn)移，從而導致根據(jù)線粒體基因片段建立的物種鑒別體系不能反映真正自然的物種之間的關系[13]。而且，小范圍地區(qū)或有限的取樣可能導致錯誤估計物種之間的變異[8， 14]。所以，在設計準確鑒別體系的方案時，必須考慮取樣的大小，并同時考慮線粒體DNA和核糖體DNA。

但DNA分類也存在著一些問題。首先，DNA分類還并非是一種低成本的技術，它可能會將一些在資金和技術上存在困難的分類學家排斥在外[15]；其次，選擇哪一段序列用于分析，目前還未達成共識；而對這些序列的比對也將面臨多方面的困難[16]。如果種類的親緣關系過近，任何基因都可能變得無用[17]。且從不同的基因組（核基因組或細胞器基因組）中選取的序列可能會得出不同的分類結(jié)果[18]。

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