袁秀云，梁 芳，蔣素華，王默霏，劉 佳，崔 波*

(1.鄭州師范學(xué)院 生物工程研究所，河南 鄭州 450044;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

PEBP 家族基因廣泛存在于細(xì)菌［1］、酵母［2］、植物［3］和動(dòng)物［4-5］中，其編碼的蛋白序列與磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)和Raf 激酶抑制劑蛋白(Raf kinase inhibitorprotein，RKIP)相似，包含單一保守的PEBP/RKIP 結(jié)構(gòu)域。近年來，從植物中發(fā)現(xiàn)了大量的PEBP家族基因，例如在雙子葉植物擬南芥［6］、葡萄［7］、番茄［8］和楊樹［9］中發(fā)現(xiàn)有6～9 個(gè)，單子葉植物水稻［10］、小麥［10］和玉米［11］中的分別有19 個(gè)、20 個(gè)和24 個(gè)PEBP 家族基因。通過對(duì)植物PEBP 家族基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，PEBP 基因家族分為FT-like、MFT-like 和TFL1-like 3 個(gè)亞家族［11］。在植物PEBP 家族基因的研究中，F(xiàn)T-like 和TFL1-like 基因的研究相對(duì)較多，F(xiàn)T-like 基因是植物開花的誘導(dǎo)因子，也被認(rèn)為可能是植物開花素的組分之一，具有促進(jìn)開花的作用［12-13］，而TFL1-like 基因是花發(fā)育的抑制基因，能夠維持植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和花序的無限生長(zhǎng)狀態(tài)［14-16］，而MFT-like 基因在植物中研究還很少，其功能還知之尚少，可能有冗余的成花誘導(dǎo)作用，還可能與種子的發(fā)育有關(guān)［11，17］。由于PEBP 家族基因在植物發(fā)育特別是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)發(fā)育轉(zhuǎn)變過程中的調(diào)控作用及在植物育種中的應(yīng)用前景，其功能研究及作用機(jī)制成為目前研究熱點(diǎn)之一。隨著擬南芥和水稻等模式植物分子生物學(xué)研究的不斷深入，人們對(duì)PEBP 家族基因在植物發(fā)育過程中的作用有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，但是不同植物中具有多個(gè)PEBP 家族基因，多數(shù)基因的功能還不清楚，其蛋白的作用機(jī)制還不明確，因此為了更加清楚地了解植物PEBP 家族基因的作用機(jī)制，需要深入研究PEBP 家族基因在不同植物中的功能。

文心蘭為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬(Oncidium)，又名舞女蘭，由于其花形優(yōu)美、花色亮麗，具有良好的觀賞價(jià)值，近年來在國(guó)際及國(guó)內(nèi)花卉市場(chǎng)倍受青睞，是洋蘭類常見花卉，花期轉(zhuǎn)變的調(diào)控機(jī)制是研究的主要內(nèi)容，也是其栽培和育種的理論基礎(chǔ)。Hou 和Yang 從文心蘭(O.‘Gower Ramsey’)中鑒定出2 個(gè)PEBP 家族基因OnFT 和OnTFL1，與擬南芥的FT 和TFL1 同源，同時(shí)能夠調(diào)控文心蘭的成花轉(zhuǎn)變［18］。顯然，目前文心蘭PEBP 家族基因的研究還在起步階段，研究結(jié)果還不能對(duì)文心蘭PEBP 家族基因有全面認(rèn)識(shí)。本研究以文心蘭雜交品種(Oncidium‘Sweet Sugar’)為材料，利用RT-PCR 技術(shù)克隆到一個(gè)PEBP 家族基因(OnTF-like)，采用RT-qPCR 方法，對(duì)文心蘭不同時(shí)期不同器官中OnTF-like 的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，并構(gòu)建了該基因的正義和反義表達(dá)載體。該研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明PEBP家族基因在文心蘭組織中的表達(dá)特性及分子調(diào)控機(jī)制，并為今后通過基因工程技術(shù)進(jìn)行遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用文心蘭(O.Sweet Sugar)來自鄭州師范學(xué)院智能溫室，用文心蘭花蕾期葉片為材料進(jìn)行基因克隆。另外分別取成苗期(沒有花葶抽出)、花蕾期(花葶抽出，有花蕾，無開花)、盛花期(花葶上大部分花蕾盛開)、花后期(開花過程結(jié)束，花枯萎脫落)的葉片、根、花葶、花瓣、柱頭、萼片等材料進(jìn)行表達(dá)分析。所有材料取后迅速用液氮速凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成

將文心蘭不同組織在液氮中研磨至粉狀，用Trizol(Invitrogen 公司)試劑提取其總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的完整性，以核酸蛋白分析儀(Q5000，Quawell，USA)測(cè)定其A260，A280值，計(jì)算RNA濃度和純度。以提取的總RNA 為模板，用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa 公司)合成cDNA，用于基因克隆;用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋5 倍備用于熒光定量檢測(cè)。

1.3 OnTF-like 基因序列的克隆與分析

根據(jù)GenBank 中已登錄AB052943(水稻)、AY705794(小麥)、AK376849(大麥)、NM_001112781(玉米)、GU324590(黑麥)等序列，采用Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)1 對(duì)引物，PEBP-F:5'-ATG GCC GGT AGG GAT AGG G-3'和PEBP-R:5'-GCC GTG GGT AGA TCA ATT GTA CAT-3'，用于克隆基因的編碼區(qū)序列。其PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，59.5 ℃復(fù)性40 s，72 ℃延伸40 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過凝膠回收，與pMD19-T vector(TAKARA)連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及PCR 鑒定后送去測(cè)序。

已有序列的檢索使用GenBank 的Blast 在線分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/);系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGA4.0 軟件的Neighbor-joining 法建成。

1.4 qRT-PCR 分析

根據(jù)基因的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)1 對(duì)定量引物qRT-F:5'-TCGTGATGGTAGACCCAGATG-3＇和qRT-R:5'-GCTCTCATAGCACATCACTTCCT-3';以文心蘭的GAPDH 基因(GenBank 登錄序列號(hào)為:JN981141)作為內(nèi)參基因，其引物設(shè)計(jì)為qRT-GF:5'-GCTGCTAAGGCTGTGGGTA-3'和qRT-GF:5'-CTTGCCCTCAGACTCTTCCT-3'。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit(TaKaRa)，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40 次循環(huán)，每次循環(huán)的第3 步進(jìn)行熒光采集。qRT-PCR 反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，3 次技術(shù)重復(fù)，2 次生物學(xué)重復(fù)，并做陰性對(duì)照。通過溶解曲線和擴(kuò)增曲線確定引物的特異性。試驗(yàn)輸出的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析處理。目的基因相對(duì)表達(dá)量Rel.Exp=2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct(OnTF-like)-Ct(GAPDH)，ΔΔ Ct=(各植物組織ΔCt)-(苗期葉ΔCt)

1.5 OnTF-like 基因正義和反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將正向引物PEBP-F 的5＇端分別引入Bgl II 和Nhe I 限制性內(nèi)切酶，將反向引物PEBP-R 的5＇端分別引入Nhe I 和Bgl II 限制性內(nèi)切酶，以1.3 步驟中插入OnTF-like 片段的pMD19-T 質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用于構(gòu)建正義和反義表達(dá)載體。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃變性5 min;94 ℃變性35 s，59.5℃退火35 s，72 ℃延伸40 min，35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將目的片段連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 菌株，測(cè)序進(jìn)行ORF 序列驗(yàn)證，得到的陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pMD-OnTF-like-S 和pMD-OnTF-like-A。

以改造的pCAMBIA1301 質(zhì)粒(修改了Nco I 酶切位點(diǎn))為表達(dá)載體，將pCAMBIA1301 用Bgl II 和Nhe I 限制性內(nèi)切酶不完全消化，回收pCAMBIA1301 質(zhì)粒經(jīng)酶消化后的9 844 bp 的載體片段，再分別將pMD19-OnTF-like-S 和pMD19-OnTF-like-A 質(zhì)粒用Bgl II 和Nhe I 限制性內(nèi)切酶徹底消化，獲得558 bp的目的基因片段。將回收的表達(dá)載體片段與目的基因片段經(jīng)T4 連接酶16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性菌落，重組質(zhì)粒命名為1301-OnTF-like-S(正義植物表達(dá)載體)和1301-OnTF-like-A(反義植物表達(dá)載體)，提取質(zhì)粒后以限制性內(nèi)切酶Sph I 酶切鑒定，預(yù)期獲得8 632 bp 和1 757 bp 2 條片段，酶切鑒定正確的質(zhì)粒再次測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnTF-like 基因序列的克隆

以文心蘭花蕾期葉片的總RNA 為模板，利用引物PEBP-F 和PEBP-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到預(yù)期546 bp 的片段，此片段包含一個(gè)531 bp 的開放閱讀框，編碼177 個(gè)氨基酸(圖1)。在NCBI 上進(jìn)行Blastn 分析，發(fā)現(xiàn)此序列與大花蕙蘭(Cymbidium hybrid，KF669643)、蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrid，KC138805)的FT-like 基因有99%的相似性、與萼脊蘭(Sedirea japonica，KF669644)和小麥(Triticum aestivum，AY705794)的TaFT 基因有98%的相似性，故將此基因命名為OnTF-like，登錄號(hào)為KF669642，蛋白登錄號(hào)為AHB86975。

圖1 OnTF-like 基因的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide acid sequence and deduced amino sequence of OnTF-like gene

2.2 OnTF-like 基因的氨基酸序列比對(duì)及其系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 OnTF-like 蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 OnTF-like conservative protein domain structure

利用NCBI 中的BLASTx 工具把OnTF-like 的核酸序列翻譯成氨基酸序列，通過蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列包含一個(gè)PEBP 功能域(圖2)。序列比對(duì)分析表明，OnTF-like 的氨基酸序列與小麥TaFT(ACA25439)、山羊草(Aegilops tauschii)FT(ABI34864)、蝴蝶蘭FT(AGE45850)，萼脊蘭SePEBP(AHB86977)，大麥(Hordeum vulgare subsp)HvFT1(AAZ38709)的同源性為99%，與黑麥草FT3(Lolium perenne，CBN73215)和草甸羊茅(Festuca pratensis)FT3(CBN73209)的同源性為97%，與高粱(Sorghum bicolor)的預(yù)測(cè)蛋白PEBP(XP_002436509)同源性為96%，與玉米(Zea mays)ACN15(NP_001106252)同源性為94%，與野生稻(Oryza rufipogon)Hd3a(BAO03052)的同源性為92%。與Hou 和Yang 報(bào)道的OnFT(EU583502)核苷酸序列具有69.41%的相似性，氨基酸序列具有78.535 相似性。

圖3 OnTF-like 氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of OnTF-like amino acid sequences

為更好地了解OnTF-like 與其它PEBP 家族基因之間的進(jìn)化關(guān)系，選取有代表性的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果表明所分析的PEBP 蛋白明顯分為FT-like、MFT-like 和TFL1-like 3 個(gè)亞家族。文心蘭OnTF-like 氨基酸屬于FT-like 亞家族基因編碼，與蘭科植物蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrid)FT(AGE45850)親緣關(guān)系最近，與雙子葉植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)的FT(AB027504)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而與文心蘭(Oncidium Gower Ramsey)的另一FT 基因(EU583502)和蕙蘭(Cymbidium faberi)的FT(HQ164434)關(guān)系也較遠(yuǎn)，說明PEBP 亞家族成員存在種屬特異性，同時(shí)也可以看出同一物種的同一類PEBP 亞家族成員序列存在較大差異，可能與其不同的功能有關(guān)。

2.3 OnTF-like 基因的表達(dá)分析

為分析文心蘭OnTF-like 基因在植株發(fā)育過程中不同組織中的表達(dá)特性，以成苗期、花蕾期、盛花期和花后期4 個(gè)時(shí)期的根、葉、花葶及盛花期的花萼、側(cè)瓣、唇瓣和蕊柱等14 個(gè)組織的總RNA 為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。結(jié)果見圖4，可以看出文心蘭OnTF-like 在所有時(shí)期的根和花器官組織中沒有檢測(cè)到表達(dá)，在盛花期、花后期的葉片和花葶中也沒有表達(dá)，而在苗期的葉片及花蕾期的葉片和花葶中檢測(cè)到表達(dá)，其中花蕾期的花葶中表達(dá)水平最高，苗期的葉片中表達(dá)水平最低。由此推測(cè)，文心蘭OnTF-like 基因參與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，與開花進(jìn)程有關(guān)，而與花器官發(fā)育無關(guān)。

圖4 OnTF-like 基因的表達(dá)特性分析Fig.4 Analysis on the expression level of OnTF-like gene

2.4 正義和反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用引入限制性內(nèi)切酶Bgl II 和Nhe I 的引物從插入OnFT-like 基因的pMD19-T 克隆載體上擴(kuò)增ORF 目的片段(圖5a)，凝膠回收后再次鏈接pMD19-T，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過篩選得到的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD19-OnTF-like-S 和pMD19-OnTF-like-A。將pCAMBIA1301 質(zhì)粒Bgl II 和Nhe I 酶切消化，切膠回收約9 830 bp的片段大片段(圖5b)，質(zhì)粒pMD19-OnFT-S 和pMD19-OnFT-A 經(jīng)Bgl II 和Nhe I限制性內(nèi)切酶酶切消化后，切膠回收小片段(圖5b)。將回收的pCAMBIA1301 載體片段與pMD19-On-FT-S 和pMD19-OnFT-A 的小片段用T4 DNA 連接酶連接，然后轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)過Sph I 酶切鑒定(圖5c)及測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建了正義植物表達(dá)載體1301-pMD19-OnFT-S 和反義植物表達(dá)載體1301-pMD19-OnFT-A(圖6)。

圖5 OnFT-like 表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.5 Construction and restriction enzyme digestion of expression vectors of OnFT-like

圖6 植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.6 The schematic of the plant expression vector construction

3 討論

本研究通過RT-PCR 的方法，從文心蘭雜交種‘Sweet Sugar’中克隆了1 個(gè)PEBP 家族基因，該基因編碼177 個(gè) 氨基酸，具有典型的PEBP 蛋白結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列比對(duì)分析表明，該基因?qū)儆贔T-like 亞家族，與許多單子葉植物的FT 類基因具有90%以上的相似性，其中與蝴蝶蘭、小麥、黑麥草、山羊草、萼脊蘭、大麥等的FT 類基因具有99%以上的相似性;可見該基因的氨基酸序列高度保守。而該基因與曾報(bào)道的文心蘭(O.Gower Ramsey)OnFT 序列差異相對(duì)較大［18］，說明了文心蘭PEBP 基因的FT-like 亞家族中具有多個(gè)成員，這個(gè)結(jié)果與水稻、玉米和小麥等具有多個(gè)PEBP 家族基因結(jié)果一致［10-11］。

文心蘭OnFT-like 基因在根中沒有表達(dá)，在成苗期的葉片中有表達(dá)，結(jié)果與OnFT 的表達(dá)分析一致。據(jù)報(bào)道，文心蘭OnFT 基因除了在幼苗期的葉片和成苗期的葉片中表達(dá)外，在花蕾及部分花器官中也有表達(dá)［18］，說明文心蘭OnFT 基因與本研究的OnFT-like 基因功能有很大差異，也進(jìn)一步說明，二者基因序列的差異不僅僅是品種的差異，更主要的是PEBP 家族及FT-like 亞家族基因功能分化的差異，但二者的研究也表明，盡管表達(dá)特性有所不同，但都與開花進(jìn)程有關(guān)，說明FT-like 亞家族基因功能也具有保守性。玉米［11］、墨蘭［19］、大麥［17］及挪威云杉［20］等多個(gè)研究也表明PEBP 家族成員表達(dá)特性和功能具有差異，大部分基因能夠直接或間接影響開花時(shí)間和花序形態(tài)，同時(shí)其功能也受光周期的影響，而文心蘭作為蘭科植物，一般認(rèn)為其開花主要受溫度調(diào)控，與光周期的關(guān)系不大，其開花進(jìn)程受哪些PEBP 基因的調(diào)控及它們?cè)陂_花進(jìn)程中是否也受光周期的影響是值得深入研究的課題。

本研究結(jié)果表明，文心蘭OnFT-like 基因在蕾期花葶中高表達(dá)，與開花進(jìn)程有關(guān)，而在盛花期和花后期的花葶中沒有檢測(cè)到表達(dá)，又說明不具維持開花的功能，而該基因的具體功能及其調(diào)控機(jī)制如何，有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)室正在嘗試?yán)谜x和反義基因技術(shù)研究文心蘭OnFT-like 基因的過量表達(dá)和反義RNA 干擾對(duì)植物發(fā)育的影響，最終揭示其在生殖發(fā)育中的調(diào)控作用。本研究已成功構(gòu)建正義和反義植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步探討文心蘭OnFT-like 基因的功能及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為創(chuàng)造出更具觀賞價(jià)值的早花品種提供技術(shù)支持。

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