李國雷，廖 敏，張 楠，陳 娜，黃 宇

(1.浙江省亞熱帶土壤與植物營養(yǎng)重點實驗室，浙江 杭州 310058;2.浙江省象山縣農(nóng)林局，浙江 象山 315700;3.浙江大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 310058)

研究表明，蚯蚓是陸地生態(tài)系統(tǒng)中生物量最大的無脊椎土壤動物，其肌體可提供蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物元素等動物需要的營養(yǎng)物質(zhì)，以及抗氧化酶、溶栓酶、溶血素和抗腫瘤成分等生物活性成分［1-5］。其中干蚯蚓體內(nèi)含蛋白質(zhì)量高達70%左右，因此蚯蚓體可作為氨基酸制作的重要原料，這成為提高蚯蚓經(jīng)濟效益的重要途徑，已成為蚯蚓綜合利用的研究熱點［6］。目前有關(guān)動植物蛋白制備氨基酸的工藝研究表明，酶法水解工藝往往成為首選［7-9］，因為酶法水解反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)效率高，既不破壞氨基酸，也不產(chǎn)生消旋作用;同時酶法水解生成的部分小分子肽具有生物活性，可促進動物的免疫能力和生產(chǎn)性能提升。

目前有關(guān)蚯蚓蛋白質(zhì)酶水解工藝及其產(chǎn)物的研究，文獻報道主要集中在引入外源酶方面［9-11］，如劉波等［9］研究發(fā)現(xiàn)，枯草蛋白酶(Asl.398)可顯著促進蚯蚓蛋白質(zhì)的水解，酶解產(chǎn)物中主要由分子量5 000以下的多肽、小分子肽及氨基酸組成，其中220 分子量以下的組份占72.09%，氨基酸組成平衡，表明外源酶水解蚯蚓蛋白具有一定的應(yīng)用潛力［9］，但外源酶的引入，必然增加生產(chǎn)的投入。研究表明，蚯蚓消化道有10 多種蛋白水解酶，包括纖溶酶等，這些酶具有較強的蛋白質(zhì)水解活性［9-11］，因此，是否可利用蚯蚓自身水解酶酶解蚯蚓蛋白質(zhì)，獲取活性成分完全保留、營養(yǎng)價值高的蚯蚓水解液，但目前相關(guān)研究報道較少，而開發(fā)利用蚯蚓自身水解酶酶解蚯蚓蛋白質(zhì)的工藝，將有助于提高酶解蚯蚓蛋白質(zhì)工藝經(jīng)濟效益，是投入最少，易于操作，且保留蚯蚓活性成分最多的有效方法。鑒此，本研究將系統(tǒng)地研究利用蚯蚓自身水解酶自溶水解蚯蚓蛋白的工藝及其產(chǎn)物組成特征，篩選確定蚯蚓蛋白酶自溶水解的最佳工藝條件，為提高蚯蚓利用途徑和經(jīng)濟效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

太平二號新鮮蚯蚓，由寧波龍興生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司提供，水分81.23%，粗蛋白(干質(zhì)量)約65.78%。茚三酮和甘氨酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗儀器

DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁攪拌水浴鍋(上海羌強儀器設(shè)備有限公司)，ML-204 分析天平(上海梅特勒-托利多)，低溫大容量離心機GTR10-1(北京時代北利離心機有限公司)，P-752 型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，DS-200 高速組織搗碎機(江蘇無錫沃信儀器有限公司)，Waters2695 高效液相色譜(美國WATERS 公司)，835-50 型日立氨基酸分析儀等。

1.3 蚯蚓自溶水解

洗凈蚯蚓，盡量讓蚯蚓吐出體內(nèi)的食物殘渣。稱取100 g 蚯蚓用高速組織搗碎機搗碎，加入一定體積的水，一定pH 下自溶水解，保溫反應(yīng)一定時間，沸水浴100 ℃加熱滅活60 min，室溫放置30 min，之后4 500 r/min 下離心10 min，取上清液，密封分裝備用待側(cè)。

1.4 自溶水解工藝條件優(yōu)化

酶解體系pH 值、溫度、時間、底物濃度(蚯蚓與水的重量比)等是影響自溶酶解工藝酶解效果的主要因素。本研究針對溫度、pH、時間、蚯蚓與水的比例等對自溶水解反應(yīng)的影響進行了單一因素及正交試驗，進而確定最佳自溶酶解工藝條件。

1.5 水解產(chǎn)物指標測定

(1)氨基酸的測定?？偘被岵捎密崛壬ǎ?2］;氨基酸組成采用氨基酸分析儀測定，測定時樣品經(jīng)高速(12 000 r/min)、低溫(4 ℃)離心15 min，后用0.45 μm 濾膜過濾。

(2)多肽濃度。采用三氯乙酸(TCA)結(jié)合福林酚法測定多肽濃度［13］。

(3)酶解產(chǎn)物分子量分布。以Waters2695 高效液相色譜，采用標準曲線法測定酶解樣品的相對分子質(zhì)量［9］。分析條件:300 mm×7.8 mm TSK gel 2000 SWXL 色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為乙腈/水/三氟乙酸(45/55/0.1(V/V))，流速0.5 mL/min，UV200 nm 下檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 自溶酶解工藝條件優(yōu)化

(1)水解體系溫度對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響。圖1 是保持鮮蚯蚓與水的重量比為1∶1.5，水解體系pH=7.0，水解時間48 h 的條件下，蚯蚓蛋白酶自溶水解效果隨水解體系溫度變化的結(jié)果，水解體系溫度梯度分別為45 ℃，50 ℃，55 ℃，60 ℃，由圖1 可知隨著水解體系溫度的增加，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量都先上升后下降，50 ℃時，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量達到峰值，之后逐漸下降，至55 ℃之后，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量趨于平緩。由于水解體系溶液中總氨基酸減去游離氨基酸結(jié)果即為多肽濃度，可見，多肽濃度隨水解體系溫度變化不明顯，溫度之間差異不顯著(P＜0.05)?？梢?，蚯蚓蛋白酶自溶水解最佳活性溫度是50 ℃，此時，蚯蚓蛋白酶自溶水解蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)能力最強。

圖1 水解體系溫度對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響Fig.1 Effect of the temperature of hydrolysis system on earthworm self enzymatic hydrolysate

圖2 水解體系起始pH 對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響Fig.2 Effect of the initial pH of hydrolysis system on earthworm self enzymatic hydrolysate

(2)水解體系pH 對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響。圖2 是保持鮮蚯蚓與水的重量比為1∶1.5，水解體系溫度梯度50 ℃，水解時間48 h 的條件下，蚯蚓蛋白酶自溶水解效果隨水解體系pH 變化的結(jié)果，水解體系pH 分別為5.0，6.0，7.0，8.0，由圖1 可知隨著水解體系pH 的增加，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量都先上升后下降，pH7.0 時，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量達到峰值，之后逐漸下降，至pH7.0 之后，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量趨于平緩。由于水解體系溶液中總氨基酸減去游離氨基酸結(jié)果即為多肽濃度，可見，多肽濃度隨水解體系溫度變化不明顯，無顯著差異(P＜0.05)?？梢姡球镜鞍酌缸匀芩庾罴鸦钚詐H 是7.0，此時，蚯蚓蛋白酶自溶水解蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)能力最強。

圖3 水解體系鮮蚯蚓與水的重量比對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響Fig.3 Effect of the weight ratio of fresh earthworm to water on earthworm self enzymatic hydrolysate

圖4 水解時間對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on earthworm self enzymatic hydrolysate

(3)水解體系中鮮蚯蚓與水的重量比對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響。圖3 是水解體系pH=7.0，水解體系溫度梯度50 ℃，水解時間48 h 的條件下，蚯蚓蛋白酶自溶水解效果隨水解體系鮮蚯蚓與水的重量比變化的結(jié)果，水解體系鮮蚯蚓與水的重量比分別:1∶1.1，1∶1.5，1∶2.0，由圖3 可知隨著水解體系鮮蚯蚓與水的重量比的增加，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量都先上升后下降，鮮蚯蚓與水的重量比為1∶1.5 時，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量達到峰值，之后逐漸下降。由于水解體系溶液中總氨基酸減去游離氨基酸結(jié)果即為多肽濃度，可見，多肽濃度隨水解體系鮮蚯蚓與水的重量比變化不明顯，差異不顯著(P＜0.05)?？梢?，蚯蚓蛋白酶自溶水解最佳反應(yīng)的鮮蚯蚓與水的重量比是1∶1.5，此時，蚯蚓蛋白酶自溶水解蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)效果最好。

(4)水解體系中水解時間對蚯蚓蛋白酶自溶水解的影響。圖4 是水解體系pH=7.0，水解體系溫度梯度50 ℃，鮮蚯蚓與水的重量比為1.5，蚯蚓蛋白酶自溶水解效果隨水解時間變化的結(jié)果，水解時間分別為24，36，48，60 h，由圖4 可知，隨著水解時間的增加，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量都先上升后下降，水解時間為48 h 時，水解體系溶液中游離氨基酸和總氨基酸量達到峰值，之后逐漸下降。而由水解體系溶液中總氨基酸減去游離氨基酸結(jié)果所得的多肽濃度，隨水解時間的變化不明顯，差異不顯著(P＜0.05)?？傮w而言，蚯蚓蛋白酶自溶水解反應(yīng)的最佳時間是48 h，此時，蚯蚓蛋白酶自溶水解蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)效果最好。

(5)蚯蚓自溶酶解試驗正交分析結(jié)果。對上述蚯蚓自溶酶解試驗的4 個影響因素的結(jié)果進行以游離氨基酸數(shù)和總氨基酸為指標的正交試驗極差分析可以發(fā)現(xiàn)(表1)，影響蚯蚓自溶酶解蚯蚓蛋白的上述4 個因素主次關(guān)系為:鮮蚯蚓與水的重量比＞溫度＞酸堿度＞時間，即:鮮蚯蚓與水的重量比是影響蚯蚓自溶酶解的最主要因素，其次是溫度，再次為酶解pH，最后為時間。根據(jù)上述結(jié)果可得出，蚯蚓自溶酶解的最佳條件組合為:pH 7.0、鮮蚯蚓與水的重量比1∶1.5、溫度50 ℃、反應(yīng)時間48 h，在此條件下，每100 g 鮮自溶酶解可獲游離氨基數(shù)8.92 g，總氨基酸量10.83 g，水解產(chǎn)物中的游離氨基酸和總氨基酸量占蚯蚓總蛋白質(zhì)的比例分別為72.24%和87.71%，其中約15.47%的蚯蚓蛋白質(zhì)水解為活性較高的小分子肽，總水解率接近90%，這一結(jié)果與劉波［9］等采用枯草蛋白酶(Asl.398)水解蚯蚓蛋白質(zhì)的效果相比有顯著提高，相比而言，枯草蛋白酶(Asl.398)的總水解率只有32.33%，可見最佳條件下利用蚯蚓自溶酶解工藝是獲得高活性復(fù)合蚯蚓氨基酸，提高蚯蚓利用途徑和經(jīng)濟效益有效的技術(shù)選擇。

表1 自溶酶解蚯蚓正交試驗L9(34)極差分析結(jié)果Tab.1 Results of range analyses for orthogonal experiment L9(34)of earthworm hydrolysate with self enzymes

此外對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表2。由表2 可知根據(jù)F 值小，進一步可知影響蚯蚓自溶酶解蚯蚓蛋白形成游離氨基酸及氨基酸總量的上述四個因素主次關(guān)系為:鮮蚯蚓與水的重量比＞溫度＞酸堿度＞時間，其中鮮蚯蚓與水的重量比、溫度、酸堿度的影響達到了差異顯著水平(P＜0.05)。上述結(jié)果進一步說明進行蚯蚓自溶酶解的最佳條件是:pH 7.0、鮮蚯蚓與水的重量比1∶1.5、溫度50 ℃、反應(yīng)時間48 h，此時產(chǎn)物中的游離氨基酸量和總氨基酸量最大。

表2 自溶酶解蚯蚓正交試驗L9(34)方差分析結(jié)果Tab.2 Results of variance analysis for orthogonal experiment L9(34)of earthworm hydrolysate with self enzymes

2.2 自溶酶解產(chǎn)物分析

(1)自溶酶解產(chǎn)物分子量分布。由圖5 和表3 可知:最佳自溶酶解條件下，蚯蚓的酶解產(chǎn)物中，大部分是分子量在5 000 以下的多肽、小肽及氨基酸，其中分子量300～5 000的占了約9.40%，分子量300以下占了88.44%，這表明蚯蚓通過自身蛋白水解酶自溶酶解，酶解產(chǎn)物以小分子量氨基酸和肽為主，水解效果良好。這一結(jié)果也進一步表明，利用蚯蚓自身體內(nèi)的酶進行蚯蚓的自溶水解，生產(chǎn)復(fù)合氨基酸產(chǎn)品具有可行性，采用該工藝，其生產(chǎn)成本將相對較低。同時由于自溶酶解產(chǎn)物中，分子量300 以下占了88.44%，這為利用自溶酶解蚯蚓獲得的產(chǎn)物進一步制備新型氨基酸微量元素生化產(chǎn)品，進而再提升蚯蚓的經(jīng)濟利用價值提供了良好條件，這一結(jié)論在美國飼料管理官方協(xié)會(AAFCO)的規(guī)定中得到支持，其明確指出利用可溶性金屬鹽中金屬離子與氨基酸制備氨基酸微量元素螯合物的摩爾比為1∶1 或1∶3，其中1∶2 較理想，氨基酸分子量平均為150 左右，獲得的螯合物分子量不得超過800［14］。

圖5 標準蛋白樣品(A)和蚯蚓自溶水解產(chǎn)物(B)高效液相色譜分析圖Fig.5 Analysis chromatogram of standard protein(A)and the earthworm self enzymatic hydrolysate(B)

表3 蚯蚓自溶酶解產(chǎn)物相對分子量的分布范圍Tab.3 Distribution of relative molecular weights of the self enzymatic hydrolysate of earthworm

(2)酶解產(chǎn)物游離氨基酸分析。由表4 可知，100 g 鮮蚯蚓自溶酶解產(chǎn)物中，賴氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸相對含量比較多，分別達到2.93、1.16、1.16、1.06 及0.92 g，自溶酶解產(chǎn)物原液中總氨基酸有10.83 g，18 種游離必需氨基酸達8.92 g，占總氨基酸的82.36%，其中鮮味氨基酸中的谷氨酸和賴氨酸分別占總氨基酸的10.71%和27.08%。由此可知，蚯蚓自溶酶解產(chǎn)物中氨基酸含量豐富，必須氨基酸含量高，且相對平衡，這一特征表明蚯蚓自溶酶解產(chǎn)物具有開發(fā)成氨基酸飼料添加劑及其它農(nóng)用生化產(chǎn)品的潛力。

表4 蚯蚓自溶酶解產(chǎn)物中游離氨基酸含量分布(g/100 g 鮮蚯蚓)Tab.4 Distribution of free amino acids content in the self enzymatic hydrolysate of earthworm(g/100 g fresh earthworm)

3 結(jié)論與討論

通過上述試驗研究表明，蚯蚓蛋白酶自溶水解工藝的最佳條件是:pH 7.0、鮮蚯蚓與水重量比為1∶1.5、溫度50 ℃、水解反應(yīng)時間48 h，在此最佳自溶酶解條件下水解液中的氨基氮數(shù)最大，此時總水解率為90%，其中約15.47%的蚯蚓蛋白質(zhì)水解為活性較高的小分子肽，這一結(jié)果顯著高于劉波［9］等采用枯草蛋白酶(Asl.398)水解蚯蚓蛋白質(zhì)的總水解率(32.33%)［9］，原因是蚯蚓消化道有包括纖溶酶等在內(nèi)的10 多種蛋白水解酶，這些酶都具有較強的蛋白質(zhì)水解活性［1-5］，水解過程相互協(xié)同的結(jié)果。同時獲得的酶解產(chǎn)物中大部分是分子量5 000以下的多肽、小肽及氨基酸組成，其中分子量在300 以下的占比接近90%，達到了88.44%。同時研究結(jié)果表明水解產(chǎn)生的氨基酸中組成平衡，含有18 種必需氨基酸，其中賴氨酸、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和精氨酸相對含量比較多，特別是鮮味氨基酸中的谷氨酸和賴氨酸分別占總氨基酸的10.71%和27.08%。相似的結(jié)果在劉波等［9］及王彬彬等［10-11］在采用Asl.398枯草中性蛋白酶酶解蚯蚓試驗結(jié)果得到證實?？梢婒球咀匀苊附猱a(chǎn)物中氨基酸含量豐富，必須氨基酸含量高，且相對平衡，這一特征表明蚯蚓自溶酶解產(chǎn)物可用于制取氨基酸飼料添加劑及其它農(nóng)用生化產(chǎn)品，如氨基酸葉面肥、復(fù)合蚯蚓氨基酸營養(yǎng)保健液、氨基酸農(nóng)藥等。相似應(yīng)用方式在其他高蛋白物質(zhì)酶解再加工研究中得到驗證［11，15-17］。

此外試驗結(jié)果表明，蚯蚓蛋白酶自溶水解產(chǎn)物中除了豐富的游離氨基酸外，還含有一定量的小分子肽，研究發(fā)現(xiàn)約15.47%的蚯蚓蛋白質(zhì)水解為活性較高的小分子肽，說明蚯蚓蛋白酶自溶水解產(chǎn)物也可作為小分子肽類添加劑制備的重要原料。有關(guān)蛋白質(zhì)在腸道中的吸收利用研究表明，蛋白質(zhì)在腸道中并非全部水解為氨基酸，以自由氨基的形式吸收和轉(zhuǎn)運的為80%，其余很大一部分為小分子肽(主要是二肽、三肽)，因此，對于飼料而言，要想獲得最佳生產(chǎn)性能，必須要有一定量的完整氨基酸和小分子肽存在飼料中［18］。可見，蚯蚓蛋白酶自溶水解產(chǎn)物是制備這類高生產(chǎn)性能飼料的重要可選原材料，而蚯蚓來源廣泛，成本相對低，極具開發(fā)潛力［19］。另外研究中發(fā)現(xiàn)，蚯蚓酶自溶酶解產(chǎn)物中游離的谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸等相對含量比較高，而以谷物為主的飼料原料中的賴氨酸含量甚低，且加工過程中易被破壞導(dǎo)致缺乏，這樣添加蚯蚓酶解產(chǎn)物能起到平衡氨基酸的作用，提高飼料的營養(yǎng)價值。同時由于蚯蚓酶解產(chǎn)物中賴氨酸和谷氨酸含量相對較多，具有調(diào)節(jié)食物口味作用，添加蚯蚓酶解產(chǎn)物后，將提高動物的適口性和采食量。因此充分利用蚯蚓的生物活性成分和氨基酸組成特征，對蚯蚓進行深加工，生產(chǎn)高生產(chǎn)性能的動物飼料將是一重點方向。

總之通過上述研究表明，蚯蚓可通過自身蛋白酶水解，獲得氨基酸和活性小分子肽豐富的水解產(chǎn)物，該方法對蚯蚓進行進一步深加工，提高經(jīng)濟效益而言，是一相對價廉，投入少，且實施方便的工藝，可見其應(yīng)用前景廣闊。

［1］武金霞，趙曉瑜.蚯蚓體內(nèi)生物活性成分的研究［J］.自然雜志，2004(26):27-30.

［2］Zhao J，Li L，Wu C，et al.Hydrolysis of fibrinogen and plasminogen by immobilized earthworm fibrinolytic enzyme II from Eisenia fetida［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2003，32(3-5):165-171.

［3］Wu J X，Zhao X Y，Pan R，et al.Glycosylated trypsin-like proteases from earthworm Eisenia fetida［J］.Biological Macromolccules，2007，40(5):399-406.

［4］Pan R，Zhao Y，He H J，et al.An enzyme from the earthworm Eisenia fetida is not only a protease but also a deoxyribonuclease［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，407(1):113-117.

［5］Yang J，Lv B Y，Zhang J，et al.Insight into the roles of earthworm in vermicomposting of sewage sludge by determining the water-extracts through chemical and spectroscopic methods［J］.Bioresource Technology，2014，154:94-100.

［6］蔡明才，艾娜，張梁，等.蚯蚓蛋白質(zhì)的自溶與開發(fā)應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報，2004，39(4):23-24.

［7］BOZA J J，Martinez-Augustin O，Baro L，et al.Protein V.enzymatic protein hydrolysates nitrogen utilization in started rats［J］.Br J Nutr，1995，73(1):65-71.

［8］馮健，高玲，劉永堅，等.草魚日糧中蝦蛋白肽對幼齡草魚生長性能的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，43(2):100-103.

［9］劉波，謝駿，鄭小平，等.蚯蚓蛋白酶解工藝及其產(chǎn)物分析［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2006，15(1):78-83.

［10］王彬彬，聶俊華，李志強，等.外源蛋白酶對蚯蚓蛋白酶解的影響［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25(1):224-228.

［11］王彬彬.蚯蚓蛋白酶解工藝與氨基酸螯合鹽的制備及生物效應(yīng)研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［12］張意靜.食品分析技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1996.

［13］Lowry O H，Rosebmugh N J，F(xiàn)arr AL，et al.Protein measurement with the folin phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193:265-275.

［14］顏新春.有機微量元素螯合物在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.飼料博覽，2005(3):46-48.

［15］朱連龍，熊愛生，彭日荷，等.酶制劑在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用及生物技術(shù)改良［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23(3):62-65.

［16］李典友，潘根興，向昌國，等.土壤中蚯蚓資源的開發(fā)應(yīng)用研究及展望［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21(10):340-347.

［17］郝曉霞，羅明，余淑嫻.酶解技術(shù)及其應(yīng)用［J］.江西科學(xué)，2007，25(3):355-357.

［18］孫忠保，閻宏.動物小肽營養(yǎng)研究新進展［J］.寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2004，25(2):80-84.

［19］Aldyama T，Mural T，Hirasawa Y.Supplementation of various meals to fish meal diet for chum salmon fry［J］.Aquaculture，1984，37:217-222.