張 琳，魏志剛，裴婷婷，胡頌平，余 霞，張 靜，羅利軍，葉水峰，劉國(guó)蘭

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，江西 南昌 330045;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045;3.上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海 201106)

水稻是最重要的糧食作物之一，是世界1/3 人口的主要糧食來(lái)源。而蟲(chóng)害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一，其中水稻鱗翅目害蟲(chóng)如二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等是我國(guó)水稻生產(chǎn)中的主要害蟲(chóng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因蟲(chóng)害造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)近百億美元。因此，培育抗螟蟲(chóng)的水稻新品種具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用前景。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，屬于原核生物細(xì)菌綱芽胞桿菌科芽胞桿菌屬，廣泛存在于自然界［1］。1901 年日本學(xué)者首次分離出Bt 菌，并證明它對(duì)部分鱗翅目昆蟲(chóng)有毒性作用。1953 年發(fā)現(xiàn)Bt 菌的殺蟲(chóng)活性與伴胞晶體有關(guān)［2］，并證實(shí)這種伴胞晶體由蛋白質(zhì)組成［3］。這種蛋白通常被稱(chēng)作δ-內(nèi)毒素(δ-endotoxins)或殺蟲(chóng)晶體蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。隨著人們對(duì)Bt 菌及其所產(chǎn)生的殺蟲(chóng)晶體蛋白研究的逐步深入，人們已從不同的Bt 菌的亞種中分離出對(duì)不同昆蟲(chóng)(如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等)和無(wú)脊椎動(dòng)物(如螨類(lèi)、寄生線蟲(chóng)、原生動(dòng)物等)有特異毒殺作用的殺蟲(chóng)晶體蛋白。

Schnepf 和Whiteley［4］將Bt 庫(kù)斯塔克亞種菌株HD-1 中的殺蟲(chóng)晶體蛋白基因克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中，克隆了第1 個(gè)Bt 殺蟲(chóng)晶體蛋白基因［4］。Zambryskpi［5］則在1983 年成功的獲得了第1 株轉(zhuǎn)基因煙草，這兩個(gè)試驗(yàn)的成功促使了轉(zhuǎn)Bt 抗蟲(chóng)植物的出現(xiàn)。隨后，有學(xué)者將Bt 基因轉(zhuǎn)入煙草［6-8］、西紅柿［9］、棉花［10］等獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)Bt 基因植物。但獲得的這些早期的轉(zhuǎn)Bt 基因植株的抗蟲(chóng)性都很弱，難以檢測(cè)出mRNA 的轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)表達(dá)量很低?？赡芎鸵吧鶥t 基因的AT 含量高和(或)密碼子使用偏愛(ài)有關(guān)。因此，要使得Bt 基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，必須對(duì)野生Bt 基因進(jìn)行有效的改造。1990 年，Perlak 等［10］通過(guò)使用人工修飾過(guò)的cryIA(b)和cryIA(c)基因獲得了轉(zhuǎn)Bt 基因的棉花。cryIA(b)和cry-IA(c)基因在植物中的表達(dá)水平大大提高，其蛋白含量占到了植株總可溶蛋白的0.05%～0.1%，其抗蟲(chóng)效果可以滿足農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用［10］。郭三堆等［11］人工合成了全長(zhǎng)1 824 bp 的cry1Ab 和cry1Ac 融合的GFM 殺蟲(chóng)基因，結(jié)果Bt 毒蛋白在植物中的表達(dá)量提高了約100 倍［11］。第1 例Bt 轉(zhuǎn)基因水稻是由Wünn 等［12］獲得。而Maqbool［13］則報(bào)道了在1999 年首次獲得了雙價(jià)的Bt(cry1Ac+cry2A)水稻。Tu［14］則在2000 年首次報(bào)道了轉(zhuǎn)Bt 水稻的田間試驗(yàn)。到目前為止，已經(jīng)有大量的轉(zhuǎn)Bt 基因水稻的報(bào)道。林擁軍［15-16］經(jīng)人工改造獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的兩個(gè)抗蟲(chóng)基因:cry1C*和cry2A*，并培育出高抗的轉(zhuǎn)基因品系T1C-19 和T2A-1。這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系及其配制的雜種對(duì)二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲(chóng)的抗蟲(chóng)效率大于95%。為了更有利于推動(dòng)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻的商品化，Ye 等［17］采用胚乳特異不表達(dá)的rbcS 啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)cry1C*基因，得到的轉(zhuǎn)基因株系具有高抗蟲(chóng)性，Cry1C 蛋白在葉片和莖稈中高表達(dá)，而在胚乳的表達(dá)量極低［17］。

目前，水稻生產(chǎn)主要采取噴灑殺蟲(chóng)劑來(lái)控制蟲(chóng)害。雖然化學(xué)殺蟲(chóng)劑在減少蟲(chóng)害損失起到了巨大作用，但是它的使用不可避免的造成環(huán)境污染以及威脅人類(lèi)健康，而且提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本。通過(guò)大規(guī)模的篩選，目前在水稻及其近緣種中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲(chóng)的抗性種質(zhì)資源，因此無(wú)法通過(guò)常規(guī)育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)方式來(lái)培育抗蟲(chóng)水稻新品種。通過(guò)轉(zhuǎn)基因育種的手段增強(qiáng)水稻自身的抗蟲(chóng)性是解決上述問(wèn)題的有效途徑。Bt 基因是來(lái)自于蘇云金芽胞桿菌的一種殺蟲(chóng)基因，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物可特異性毒殺不同的害蟲(chóng)，而且對(duì)人畜和環(huán)境無(wú)害，是目前轉(zhuǎn)基因育種中主要使用的抗蟲(chóng)基因。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因培育抗蟲(chóng)水稻是現(xiàn)階段及未來(lái)解決水稻蟲(chóng)害問(wèn)題的主要策略。

本研究的目的是通過(guò)傳統(tǒng)雜交的方法將3 個(gè)Bt 明恢63 中的Bt 基因，轉(zhuǎn)育到水稻品種秀水123、湘晴及節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3 號(hào)和保持系滬旱1B 中。利用分子標(biāo)記輔助選擇、田間除草劑篩選或者試紙條檢測(cè)方法，以獲得新型轉(zhuǎn)Bt 基因株系，并篩選出抗蟲(chóng)性良好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系，為后續(xù)抗蟲(chóng)育種提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供體植物材料 本試驗(yàn)研究的水稻材料為Bt 明恢63 株系:TT51(cry1Ac/Ab)、T1C-19(cry1C*)、T2A-1(cry2A*)，以上材料來(lái)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍教授。

1.1.2 受體材料 受體親本為常規(guī)粳稻品種秀水123，恢復(fù)系湘晴以及節(jié)水抗旱稻恢復(fù)系旱恢3 號(hào)和保持系滬旱1B。

1.1.3 供試?yán)ハx(chóng) 中進(jìn)行大田抗蟲(chóng)鑒定試蟲(chóng)為水稻主要鱗翅目害蟲(chóng)之一:稻縱卷葉螟。

1.1.4 試劑 1.5×CTAB;氯仿/異戊醇(24∶1);引物(序列見(jiàn)表1，由Invitrogen 公司合成)Taq 酶;Buffer;dNTP;瓊脂糖;溴酚藍(lán);EB;Basta 試劑(除草劑)等。

表1 Bt 基因擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primer of Bt gene

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 研究技術(shù)路線 利用抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因新材料T1C-19(攜帶cry1C*基因)、T2A-1(攜帶cry2A*基因)和TT5-1(攜帶cry1Ab/Ac 融合基因)為供體材料，以秀水123、湘晴、旱恢3 號(hào)和滬旱1B 為受體材料，進(jìn)行有性雜交和回交，并通過(guò)自交來(lái)獲得純合轉(zhuǎn)Bt 基因株系(圖1)。本研究主要是對(duì)回交二代自交三代(BC2F3)進(jìn)行分子標(biāo)記陽(yáng)性檢測(cè)，得到純合轉(zhuǎn)Bt 基因株系。同時(shí)，采用田間除草劑篩選、試紙條檢測(cè)方法及田間抗蟲(chóng)鑒定等方法來(lái)鑒定是否純合。

圖1 研究技術(shù)路線Fig.1 The route of study technique

1.2.2 分子標(biāo)記陽(yáng)性檢測(cè) (1)水稻葉片總DNA 提取:采用小量DNA 抽提法(CTAB 法)。

(2)PCR 擴(kuò)增:采用常規(guī)PCR 擴(kuò)增。

(3)電泳檢測(cè)。1)瓊脂糖凝膠電泳:①制膠。a.6 g 瓊脂糖加到盛有275 mL 0.5×TBE 的錐形瓶中煮沸10 min 至瓊脂糖充分溶解;b.當(dāng)錐形瓶溫度將為60 ℃左右加入12 μL 的EB 混合均勻;c.將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，在適當(dāng)?shù)奈恢貌迳鲜嶙?d.在室溫下使膠凝固，之后拔出梳子將膠放入電泳槽中。②點(diǎn)樣。模板DNA 8 μL，Maker 4 μL。③0.5×TBE 緩沖液中120V 電壓跑膠至溴酚藍(lán)跑到底。④將膠置于紫外光下觀察，拍照記錄。2)聚丙烯酰胺凝膠電泳:采用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性檢測(cè) 由于轉(zhuǎn)基因植物具有抗除草劑的特性，可以利用噴灑除草劑的方法來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性檢測(cè)方法主要有兩種:Basta 溶液涂抹葉片和Basta 溶液直接噴灑。本研究采用后一種，配制終濃度為0.3%的Basta 直接在田間噴施水稻植株，7 d 后進(jìn)行觀察。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的試紙條檢測(cè) 取標(biāo)記檢測(cè)陽(yáng)性植株葉片，加自來(lái)水于碾缽中磨碎，取汁液于離心管中，將膠體金試紙置于汁液中，觀察結(jié)果。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的田間抗蟲(chóng)鑒定 全生育期實(shí)行除不噴施農(nóng)藥外的正常田間管理，觀察轉(zhuǎn)基因植株對(duì)卷葉螟的抗性。田間種植材料整個(gè)生育期不打藥，通過(guò)自然發(fā)蟲(chóng)進(jìn)行材料選擇，由于近年螟蟲(chóng)危害較重，田間篩選結(jié)果較好。在田間共種植有BC2F3材料，根據(jù)檢測(cè)的陽(yáng)性植株以及田間發(fā)蟲(chóng)情況來(lái)進(jìn)行選種，選擇了植株表現(xiàn)上與輪回親本接近的，且抗蟲(chóng)的材料共270 份材料。

2 結(jié)果

2.1 分子標(biāo)記陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)所獲得2A 材料93 份，1C 材料112 份，1Ab/Ac 材料65 份進(jìn)行水稻植株提取DNA，通過(guò)PCR 及瓊脂糖電泳檢測(cè)，因?yàn)锽t 基因是顯性的，因此在BCnF1 代有擴(kuò)出對(duì)應(yīng)條帶的為陽(yáng)性植株(圖2、3、4)。而自交后的植株中如果全部的單株都能擴(kuò)增出Bt 基因，則為純合株系。BC2F3代PCR 檢測(cè)的結(jié)果顯示分別獲得cry1C*和cry2A*基因的一些純合株系(表2)，而cry1Ac/Ab 暫還未獲得純合株系，需下一代自交挑選。

表2 BC2F3代純合株系Tab.2 Homozygous lines of BC2F3

圖2 Cry2A* 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of Cry2A*

圖3 Cry1C* 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of Cry1C*

圖4 Cry1Ab/Ac 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoretogram of Cry1Ab/Ac

圖5 田間噴施Basta 試驗(yàn).Fig.5 Experiment of spraying Basta in field

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的Basta 噴施試驗(yàn)結(jié)果

除常規(guī)的PCR 檢測(cè)外，對(duì)cry1C*和cry2A*植株進(jìn)行0.3%的Basta 噴施檢測(cè)，進(jìn)一步確認(rèn)陽(yáng)性植株。在BC2F3代進(jìn)行的純合株系挑選，若為純合株系，則所有單株均不受Basta 損害;而雜合的則出現(xiàn)3∶1 的分離比(陽(yáng)性:陰性)，本次實(shí)驗(yàn)雜合植株總株數(shù)為192 株，其中表現(xiàn)陽(yáng)性的為144 株，表現(xiàn)陰性的為48 株;全部死亡的則為陰性株系(圖5)。

2.3 試紙條檢測(cè)結(jié)果

除常規(guī)的PCR 檢測(cè)外，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行膠體金試紙進(jìn)行蛋白的陽(yáng)性鑒定。進(jìn)一步確保篩選結(jié)果的可靠性(圖6)。其中cry1C*和cry2A*標(biāo)記結(jié)果和試紙條檢測(cè)結(jié)果相吻合。而對(duì)于Cry1Ab/Ac，PCR 結(jié)果陽(yáng)性，但試紙檢測(cè)卻為假。

圖6 試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Results of test paper detection

2.4 田間稻縱卷葉螟抗性鑒定結(jié)果

2011 年夏在上海白鶴轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地進(jìn)行材料的稻縱卷葉螟抗性鑒定。已轉(zhuǎn)入Bt 基因的植株對(duì)稻縱卷葉螟表現(xiàn)出高抗性，卷葉率為0;而陰性植株則被侵食，卷葉率平均達(dá)37.8%(圖7)。此外，含cry2A*植株的抗性相對(duì)較差，有個(gè)別植株受輕微影響，有1～2 片葉片被侵害。

圖7 田間自然感蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of natural affection of rice leaf roller in field

3 討論與結(jié)論

在轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)中普遍PCR 檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果較多，給進(jìn)一步的檢測(cè)造成麻煩。Cry1Ab/Ac 的問(wèn)題，PCR 結(jié)果陽(yáng)性，但試紙檢測(cè)卻為假。所以Cry1Ab/Ac 暫未獲得純合株系，需進(jìn)一步自交。

在選擇瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)供體-受體間差異標(biāo)記時(shí)，產(chǎn)物不清晰，即在3%瓊脂糖凝膠電泳中，供體與受體條帶一致，需用5%聚丙烯凝膠電泳才能檢測(cè)出差異。而聚丙烯酰胺凝膠在制備過(guò)程中會(huì)受到很多因素的影響:首先是催化劑AP(過(guò)硫酸銨)與加速劑TEMED(二甲基乙二胺)濃度。適量的AP與TEMED 促進(jìn)聚合，但當(dāng)其過(guò)量時(shí)會(huì)引起電泳時(shí)烘膠和譜帶變形。且溫度高時(shí)聚合快，所以應(yīng)選擇合適配方使聚合在40～60 min 中內(nèi)完成。Acr(單體丙烯酰胺)與交聯(lián)劑Bis(N，N-甲叉丙烯酰胺)的濃度也是影響凝膠形成的重要因素。此外溫度，pH，氧分子都會(huì)對(duì)凝膠的形成及凝膠的質(zhì)量造成影響。

本實(shí)驗(yàn)在使用最普遍的分子標(biāo)記輔助選擇轉(zhuǎn)Bt 基因水稻同時(shí)［18］，采用田間除草劑篩選;試紙條檢測(cè)方法;田間抗蟲(chóng)鑒定等方法相結(jié)合篩選出抗蟲(chóng)性良好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系，為后續(xù)抗蟲(chóng)育種提供材料。多種方法并用的優(yōu)勢(shì)是節(jié)省工作量以及增強(qiáng)結(jié)果準(zhǔn)確性等。通過(guò)直接對(duì)生長(zhǎng)期水稻葉片噴灑Basta 實(shí)驗(yàn)，若為陰性植株則單株死亡，可以通過(guò)此方法來(lái)減少需要進(jìn)行PCR 陽(yáng)性檢測(cè)的植株數(shù)量;此外也可以利用此方法來(lái)檢測(cè)通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇的植株是否為假陽(yáng)性，因?yàn)榧訇?yáng)性植株在噴灑Basta 液體后一周內(nèi)會(huì)死亡。試紙條檢測(cè)方法是一種高效、簡(jiǎn)便、易操作、準(zhǔn)確率高的一種方法。將待測(cè)水稻葉片加水磨成液體后利用試紙條可在一、兩分鐘內(nèi)判斷出所測(cè)材料為陰性還是陽(yáng)性。且Cry1Ab/Ac 的為假陽(yáng)性正是通過(guò)試紙條檢測(cè)方法檢測(cè)出來(lái)的。而田間抗蟲(chóng)鑒定則是檢測(cè)材料植株是否抗蟲(chóng)及抗性強(qiáng)弱的田間實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因育種的手段增強(qiáng)水稻自身的抗蟲(chóng)性，在實(shí)踐中篩選出抗蟲(chóng)性良好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系，這依然需要更多的時(shí)間與實(shí)踐。

本試驗(yàn)經(jīng)BC2F3代PCR 檢測(cè)及試紙條檢測(cè)的結(jié)果顯示分別獲得cry1C*和cry2A*基因的滬旱1B、秀水123 和湘晴的純合株系。同時(shí)，在田間自然誘發(fā)蟲(chóng)害條件下，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)稻縱卷葉螟蟲(chóng)表現(xiàn)出強(qiáng)抗性。利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)等技術(shù)可以培育出抗蟲(chóng)性、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)Bt 基因水稻株系或品種。

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