崔素梅，曹 方，蔣艷霞，霍建富(山西康寶生物制品股份有限公司，長(zhǎng)治 046011)

甘草酸二銨是從甘草中提取的a體甘草次酸衍生物，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)免疫、改善肝功能等多種作用。近年來(lái)隨著臨床研究的不斷深入，其應(yīng)用范圍不斷拓寬［1］，臨床價(jià)值極大。因此甘草酸二銨制劑的質(zhì)量，密切關(guān)系到人民群眾的用藥安全，甘草酸二銨原料藥作為制劑的源頭，把好質(zhì)量關(guān)十分必要。

甘草酸二銨原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括四方面，檢查項(xiàng)通常應(yīng)考慮安全性、有效性和純度三方面的內(nèi)容。有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)作為檢查項(xiàng)下的重要指標(biāo)，對(duì)甘草酸二銨原料藥的質(zhì)量控制起到十分重要的作用。甘草酸二銨原料藥的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)［2］中并未收入有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)目，但由于本品組成復(fù)雜，為保證產(chǎn)品批間質(zhì)量的一致性和安全性，有必要建立一種專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，并確定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

儀器:島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-M10Avp紫外檢測(cè)器。色譜柱:Apollo C18柱(250 mm ×4.6 mm，φ5 μm)。進(jìn)樣量:20 μl，試驗(yàn)試劑:乙腈為色譜級(jí)，磷酸二氫鉀、磷酸為分析純，水為純化水。

試藥:原料藥樣品批號(hào):130401、130402和130403，均為山西康寶生物制品股份有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件的建立

參照文獻(xiàn)［3，4］的高效液相色譜法建立了甘草酸二銨高效液相色譜條件。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0)(40∶60)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm。理論塔板數(shù)按甘草酸二銨峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000，在此液相色譜條件下主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度良好，符合藥典要求，使甘草酸二銨與其可能存在的雜質(zhì)及降解產(chǎn)物達(dá)到完全分離。

2.2 溶液的制備

供試品溶液的制備:精密稱(chēng)取甘草酸二銨原料25 mg，置50 ml容量瓶中，精密加入流動(dòng)相制成含量為500 μg/ml的溶液，搖勻，即得。

自身10%對(duì)照溶液的制備:精密量取供試品溶液稀釋10倍，即得含量為50 μg/ml的溶液，搖勻。

測(cè)定法:精密量取對(duì)照溶液20 μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%-25%。再精密量取對(duì)照液和供試液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍;供試品色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)的峰面積之和不得大于對(duì)照溶液主成分峰面積的10.0%。

2.3 方法學(xué)研究

2.3.1 波長(zhǎng)的選擇 精密稱(chēng)取甘草酸二銨適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，用紫外分光光度?jì)按分光光度法［3］在200-400 nm掃描，結(jié)果甘草酸二銨在252 nm±2 nm有最大吸收;由于得不到雜質(zhì)對(duì)照品，并且在預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在此波長(zhǎng)處用HPLC法檢測(cè)雜質(zhì)明顯，因此我們將測(cè)定波長(zhǎng)選為252 nm。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 分別使用乙腈、0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH值為3.0±0.05)，按不同比例配制流動(dòng)相，42∶58為流動(dòng)相1;35∶65為流動(dòng)相2;40∶60為流動(dòng)相3。

結(jié)果顯示，選用流動(dòng)相1，出峰太早，甘草酸二銨與雜質(zhì)峰未完全分離?？紤]改變流動(dòng)相極性，得流動(dòng)相2，采用流動(dòng)相2顯示，甘草酸二銨與雜質(zhì)完全分離，但出峰時(shí)間太晚。繼續(xù)改變乙腈的比例得流動(dòng)相3，結(jié)果主峰保留時(shí)間合適，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。確定流動(dòng)相條件為流動(dòng)相3。

2.3.3 空白溶劑試驗(yàn) 精密吸取流動(dòng)相20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示流動(dòng)相不影響有關(guān)物質(zhì)的檢查。

2.3.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取甘草酸二銨原料25 mg，加流動(dòng)相溶解并稀釋至50 ml，作為破壞性試驗(yàn)的貯備溶液。分別以下列條件試驗(yàn):①酸破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml，加1 mol/L鹽酸1 ml，在熱水浴中放置3 h，放涼后用1 mol/L NaOH中和，作為酸破壞樣品溶液。②堿破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml，加1 mol/L氫氧化鈉1 ml，在熱水浴中放置3 h，放涼后用1 mol/L鹽酸中和，作為堿破壞樣品溶液。③氧化破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml，加30%雙氧水1 ml，放置60 min，然后加熱少許，破壞掉溶液中殘余的雙氧水，放涼后作為氧破壞樣品溶液。④光照破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml，在(4 500±500)Lx照度下照射6 h。⑤高溫破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液適量，在沸水浴中加熱3 h，放涼后作為高溫破壞樣品溶液。分別量取上述溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。氧化破壞試驗(yàn)條件下，圖譜中未見(jiàn)有新雜質(zhì)峰產(chǎn)生，原雜質(zhì)含量增加。其他試驗(yàn)條件下，圖譜中未見(jiàn)明顯的新雜質(zhì)峰產(chǎn)生，原雜質(zhì)數(shù)目和含量未見(jiàn)增加。

經(jīng)破壞試驗(yàn)表明:本品在酸性、堿性、光照、高溫條件下較穩(wěn)定;在氧化條件下不穩(wěn)定。各供試液中雜質(zhì)與主峰的分離良好，分離度符合要求。

2.3.5 檢出限 取2.2項(xiàng)下的供試品溶液，進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)M(jìn)樣，記錄色譜圖，至主峰峰高約為基線噪音的3倍時(shí)，此進(jìn)樣量為本品的最低檢出限。結(jié)果 表明:甘草酸二銨最低檢測(cè)濃度為0.1 μg/ml，計(jì)算其最低檢出量為2.0 ng。

2.3.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品適量按上述測(cè)定方法配制成濃度為500 μg/ml的溶液，在室溫下分別放置 0，4，8，12，24 h，精密量取 20 μl注入色譜儀中，每個(gè)時(shí)點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 甘草酸二銨溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The stability results of diammonium glycyrrhizanate solution

結(jié)論:甘草酸二銨主峰峰面積基本一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%，未見(jiàn)有新雜質(zhì)出現(xiàn)，說(shuō)明本品溶液在室溫下至少24 h之內(nèi)穩(wěn)定，可滿足含量測(cè)定的需要。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取供試品適量按上述測(cè)定方法配制成濃度為500 μg/ml的溶液，精密量取20 μl注入色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，結(jié)果顯示甘草酸二銨主峰峰面積RSD值小于1.0%(見(jiàn)表2)，說(shuō)明本法精密度良好。

表2 甘草酸二銨重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The repeatability resu lts of diammonium glycyrrhizanate solution

2.3.8 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 取2.2項(xiàng)下配制的供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下的測(cè)定方法測(cè)定，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得超過(guò)5.0%，除單個(gè)雜質(zhì)峰外，其他雜質(zhì)峰面積之和不得超過(guò) 5.0%(見(jiàn)圖1，2)。

圖1 甘草酸二銨溶液有關(guān)物質(zhì)檢查色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatograms of the related substances of diammonium glycyrrhizanate solution

圖2 甘草酸二銨溶液有關(guān)物質(zhì)檢查10%自身對(duì)照色譜圖Figure 2 High performance liquid chromatograms of the related substances of 10%diammonium glycyrrhizanate solution

2.3.9 三批樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 取三批樣品按2.2項(xiàng)下的方法測(cè)定，結(jié)果顯示三批樣品的最大雜質(zhì)為3.40%，其他雜質(zhì)總和為3.35%(見(jiàn)表3)，可見(jiàn)增加有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)目很有必要，3批樣品的有關(guān)物質(zhì)均小于10.0%，考慮到本品的起始原料為中藥材的提取物以及將來(lái)生產(chǎn)的實(shí)際，我們標(biāo)準(zhǔn)中限定有關(guān)物質(zhì)為不得高于10%。

表3 三批樣品中有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Table 3 The test results of the related substances in three batches of samples

3 討論

用HPLC法測(cè)定甘草酸二銨原料藥的有關(guān)物質(zhì)，用紫外分光光度法掃描，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm，試驗(yàn)比較了多種比例的流動(dòng)相，以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0)(40∶60)為流動(dòng)相;分離效果較佳，保留時(shí)間適宜，分離度大于1.5。該方法簡(jiǎn)便可靠，精密度高，分離度好，專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于甘草酸二銨原料藥的有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。

由于該產(chǎn)品是從中藥甘草中提取的，組成復(fù)雜，雜質(zhì)種類(lèi)較多，含量高，采用自身10%對(duì)照法檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量。3批樣品的檢測(cè)，有關(guān)物質(zhì)均小于10.0%，我們標(biāo)準(zhǔn)中限定有關(guān)物質(zhì)為不得高于10%。

［1］趙蓉，呂凌.甘草酸二銨藥理研究和臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2008 4(3):31-36.

［2］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.家藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:84-85.

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典二部［M］.2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:29-31，23-24.

［4］張敏娟.RP-HPLC測(cè)定注射用復(fù)方甘草酸苷中甘草酸銨含量和有關(guān)物質(zhì)［J］.藥物分析，2008，28(5):798-800.