陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科（西安710068） 楊 光 朱延河 魏 瑾 董 新 朱參戰(zhàn) 高登峰

最新數(shù)據(jù)表明，一些膳食補(bǔ)充劑，包括硒（Se），通過對(duì)細(xì)胞表觀遺傳過程的調(diào)控，可預(yù)防多種疾?。ㄈ绨┌Y、阿爾茨海默氏病、心臟疾病等），其中可能的機(jī)制為硒通過抑制DNA轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和活性，影響DNA和組蛋白的表觀遺傳修飾調(diào)控的一些抗癌基因的表達(dá)，但具體是何種因子起決定作用尚未可知［1］。為了確定DNA甲基化修飾在由硒缺乏誘導(dǎo)的心肌損傷中作用并探索其潛在機(jī)制，本文將進(jìn)行具體探討。

資料與方法

1 動(dòng)物模型與樣品采集 60只8周齡非特異性病原體（SPF）級(jí)SD（Sprague Dawley）雄性大鼠，體重約為250g，購自維通利華實(shí)驗(yàn)所（VRL，北京）。所有大鼠以缺硒的圓酵母為基礎(chǔ)日糧，含圓酵母300g／kg，DL－蛋氨酸3g／kg，蔗糖590g／kg，玉米油50g／kg，缺硒 AIN－76A礦物組合35g／kg，碳酸鈣12g／kg，AIN－76A維生素混合物10g／kg，重酒石酸膽堿0．1g／kg和甲萘醌亞硫酸氫鈉復(fù)合物0．01g／kg，并按照0，0．1、2mg／kg的亞硒酸鈉飼料，進(jìn)行膳食補(bǔ)充。將上述大鼠正常喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組15只，含正常對(duì)照組，充足硒飼料組，缺硒飼料組。禁食過夜的大鼠用氯胺酮（Ketamine，100mg／kg）麻醉，通過頸動(dòng)脈插管法，觀測(cè)血流動(dòng)力學(xué)變化，通過含有EDTA的注射器心臟穿刺收集血液，得到最終濃度為約1g EDTA／L的血液，之后處死大鼠，將心臟取出，用生理鹽水沖洗，在4%多聚甲醛4℃下儲(chǔ)存，然后，心肌組織切片脫水，石蠟包埋，進(jìn)行伊紅染色（HE），觀察心肌的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2 細(xì)胞模型研究 新生大鼠心室肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，參照早期文獻(xiàn)得到。簡(jiǎn)單地說，取2d齡新生SD大鼠，皮膚消毒后 ，開胸取心臟，用0．06%胰蛋白酶的Hank平衡液于4℃離解過夜，培養(yǎng)基中清洗，然后用含膠原酶II，0．1%（W＝V）HBSS溶液經(jīng)過一系列的消化（37℃75rpm，8min），收集細(xì)胞，并重新懸浮于培養(yǎng)基中，自然沉降收集除第1次以外的細(xì)胞，懸液于離心試管中，將上述細(xì)胞懸液接種于6孔板中，溴脫氧尿甙（BrdU，100uM；Sigma－Aldrich公司）加入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中3～4d，以消除增殖的成纖維細(xì)胞和祖細(xì)胞，確保大于95%剩余心肌細(xì)胞是桿形的和存活后，將細(xì)胞接種于在6孔板中，貼壁生長(zhǎng)24h，用亞硒酸鹽處理，7／14d加入5－氮－2＇－脫氧胞（5－aza－dC），處理試劑每?jī)商鞊Q一次［2］。

心肌細(xì)胞裂解物用10%SDS－PAG分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，使用 Toll樣受體2（Toll－like receptor 2，TLR2），細(xì)胞間黏附因子－1（Intercellular Adhesion Molecule 1，ICAM1）和β－肌動(dòng)蛋白抗體（圣克魯斯生化科技公司，Santa Cruz）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè)TLR2，ICAM1和β－肌動(dòng)蛋白。ECL檢測(cè)系統(tǒng)（安瑪西亞，Arlington Heights）檢測(cè)蛋白條帶。抗GSTP1和DNMT1抗體分別稀釋到1∶2000和1∶500。蛋白條帶置于X射線膠片，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（Pierce公司，Rockford）觀測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，通過AFS 2201A氫化物原子吸收光譜（北京萬拓儀器公司）測(cè)定血硒濃度［3］。

結(jié) 果

1 體重、心臟重量及心臟重量／體重 不同硒濃度處理影響大鼠體重增加。缺硒飼料組體重明顯低于對(duì)照組（P＜0．001）；同時(shí)硒補(bǔ)充飲食組大鼠體重也顯著高于缺硒組（P＜0．001）。與體重一致，缺硒組心臟重量明顯低于對(duì)照組（P＜0．001）和硒補(bǔ)充飲食組（P＜0．001）。同樣，缺硒組的心臟重量／體重比值明顯低于對(duì)照組（P＜0．001）和硒補(bǔ)充飲食組（P＜0．001）。

2 動(dòng)物模型研究 不同硒濃度處理影響大鼠體重增加，飼喂硒充足飼料（0．1mg／kg）的大鼠體重為343±4g超過飼喂缺硒（278±2g），而硒的補(bǔ)充飲食大鼠體重（317±3g）也高于缺硒組，組間比較差異顯著（P＜0．01）。血流動(dòng)力學(xué)的結(jié)果表明，LVP，＋DP／DT max和－dp／dt max的缺硒組較對(duì)照組顯著降低（t＝56．29，14．89，P＜0．05）。

3 HE染色結(jié)果 HE染色顯示飼喂缺硒飼料大鼠比飼喂硒的補(bǔ)充日糧大鼠心肌的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更豐富。相反，當(dāng)大鼠喂食適當(dāng)?shù)奈澄铮?．1mg／kg），可以顯著減少心肌浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞。

4 各組大鼠的血清硒濃度 飼喂缺硒飼料大鼠的血清硒濃度為0．031±0．001ug／ml，顯著低于喂食充足硒飼料大鼠0．112±0．002ug／ml。同樣，飼喂硒適當(dāng)?shù)娘嬍常?．1mg／kg）大鼠血清硒濃度（0．095±0．001 ug／ml）顯著低于喂食高濃度硒飼料（2mg／kg）大鼠，組間比較差異有顯著性（t＝140．29，29．44，P＜0．001）。

5 甲基化狀態(tài)和TLR2在大鼠心肌中的表達(dá)水平 喂食缺硒飼料大鼠的DNA甲基化水平（33．4±4．3%）較喂食充足硒飼料大鼠（100．0±3．6%）降低66．8±11．5% （t＝11．86，P＜0．001），但其 TLR2的蛋白水平（245．0±13．5%）較喂食充足硒飼料大鼠100．0±10．3）升高121．3±58．5%（t＝20．51，P＜0．001）?？梢?，硒處理可增加心肌DNA甲基化的水平，并抑制TLR2的表達(dá)。

6 細(xì)胞培養(yǎng)的研究

6．1 DNA甲基化降低與缺硒新生大鼠：心肌細(xì)胞TLR2的表達(dá)的再活化通過 MS－PCR，RT－PCR和Western blot分析驗(yàn)證大鼠心肌細(xì)胞的甲基化狀態(tài)和TLR2和ICAM1的表達(dá)。將在缺硒（0μM）環(huán)境與0．5或1．5μM的硒環(huán)境下的大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行比較（附圖A），在缺硒環(huán)境下，心肌細(xì)胞具有顯著較低的（TLR2和ICAM1）啟動(dòng)子甲基化水平（在本次研究中為對(duì)照組的12．1±1．7%，P＜0．001），但顯著更高的為 1．5μMTLR2mRNA和蛋白水平（分別為對(duì)照組的341±49%及449±102%，P＜0．001），ICAM1mRNA和蛋白水平（分別為對(duì)照組的265±37%及231±44%，P＜0．001），通過亞硒酸鈉治療可部分激活TLR2和ICAM1的啟動(dòng)子甲基化和抑制TLR2和ICAM1的表達(dá)。

為確定負(fù)責(zé)啟動(dòng)子低甲基化和上調(diào)TLR2的基本機(jī)制，將大鼠心肌細(xì)胞分別用不同濃度的硒和5－azadC進(jìn)行處理7d。MS－PCR結(jié)果顯示，5－aza－dC處理沒有改變TLR2和ICAM1啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)（附圖B、C），在研究中使用硒的劑量為無毒的劑量，造成輕微的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與14%細(xì)胞數(shù)量的降低。在研究中使用的5－aza－dC是對(duì)DNA甲基化的最佳效果的處理劑量，但是對(duì)細(xì)胞造成顯著殺傷。

通過亞硒酸鈉處理的細(xì)胞的TLR2和ICAM1的mRNA和蛋白表達(dá)的結(jié)果與MS－PCR檢測(cè)方法一致，補(bǔ)硒處理組細(xì)胞TLR2和ICAM1的mRNA及蛋白表達(dá)較缺硒處理組均降低（分別為對(duì)照組的78%±6%），但5－aza－dC處理存在差異（附圖C）。

附圖 不同硒濃度下大鼠心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

6．2 Gadd45α可能介導(dǎo)大鼠心肌硒缺乏對(duì)DNA去甲基化的影響：為確定亞硒酸鈉處理是否會(huì)改變大鼠心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白45α（growth arrest and DNA damage inducible alpha，Gadd45α）的活性，用亞硒酸鹽或者5－aza－dC處理大鼠心肌細(xì)胞，通過RT －PCR和 Western blot分析檢測(cè)mRNA和DNMT1、Gadd45α蛋白水平。經(jīng)1．5μM 亞硒酸鹽處理的大鼠心肌細(xì)胞，Gadd45α的蛋白水平隨時(shí)間顯著下降 （P＜0．01），而用5－aza－dC處理4d的心肌細(xì)胞顯示，DNMT1蛋白的顯著減少 （為對(duì)照組的32．3±10．1%，P＜0．01），但并沒有改變 TLR2和Gadd45α的表達(dá) （分別為對(duì)照組的97．1±11．3%和12．5±21．8%，P＞0．05）。

討 論

克山病表觀遺傳中，受DNA甲基化和翻譯組蛋白修飾影響，二者在基因表達(dá)調(diào)控和維持細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)這兩方面起著重要作用［4］。

本研究以大鼠心肌細(xì)胞為模型系統(tǒng)，通過與正常大鼠心肌細(xì)胞對(duì)比，研究亞硒酸鹽處理前后缺硒大鼠心肌細(xì)胞，TLR2、ICAM1及其蛋白含量變化，來闡明TLR2和ICAM1的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制［5］。我們的結(jié)果表明，缺乏硒飲食將增加TLR2和ICAM1的蛋白水平，而硒處理后，將降低TLR2，ICAM1和DNMT1的蛋白水平，且亞硒酸鈉對(duì)上述3個(gè)基因的作用呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。結(jié)果表明［6］，硒可以通過DNA甲基化相關(guān)的染色質(zhì)修飾抑制某些炎性基因的表達(dá)。

DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（Dnmt1）主要功能是維持DNA的CpG甲基化，其活性的高低是影響DNA甲基化水平的重要因素［7］，但是本次實(shí)驗(yàn)，低硒使得甲基化酶Dnmt1表達(dá)上調(diào)，但基因組DNA甲基化水平卻在一個(gè)較低水平，并有多個(gè)炎癥因子相關(guān)基因發(fā)生低甲基化。這一矛盾現(xiàn)象說明這種基因組DNA甲基化水平逐漸下降現(xiàn)象可能不是通過下調(diào)或抑制DNA甲基化酶基因的作用實(shí)現(xiàn)的［8］。我們進(jìn)一步證明了硒缺乏在Gadd45介導(dǎo)的DNA去甲基化中的作用。Gadd45α是抑癌基因p53和BRCA1的下游靶基因，多種DNA損傷因素例如電離輻射、紫外線照射、化療藥物等作用于細(xì)胞時(shí)，可以通過不同通路誘導(dǎo)Gadd45α的表達(dá)上調(diào)，而誘導(dǎo)表達(dá)增加的Gadd45α可參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、DNA脫甲基化以及信號(hào)傳導(dǎo)等生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。研究人員證明Gadd45a的過量表達(dá)會(huì)激活甲基化沉默報(bào)告質(zhì)粒，并且促使全部的DNA去甲基化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Gadd45a的敲除會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)沉默和DNA的高度甲基化，且近日浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)研究所的研究人員在新研究中證實(shí)機(jī)體存在DNA主動(dòng)去甲基化調(diào)控機(jī)制，生長(zhǎng)阻滯與DNA損傷誘導(dǎo)蛋白Gadd45a在該過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。硒缺乏飲食，增加Gadd45α表達(dá)和調(diào)制TLR2啟動(dòng)子低甲基化，而且效果呈劑量和時(shí)間相關(guān)性。這些結(jié)果表明，硒可能通過啟動(dòng)子再次甲基化，減少Gadd45α活性，來抑制或部分抑制這些基因。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺硒飲食的大鼠心肌細(xì)胞活性DNA去甲基化過程Gadd45a蛋白可能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用。在缺乏硒的環(huán)境下，大鼠心肌細(xì)胞比細(xì)胞中硒的存在下培養(yǎng)的Gadd45α和炎性因子蛋白的表達(dá)顯著增多。硒處理后，抑制去甲基化和炎癥因子的表達(dá)，保護(hù)因炎癥性細(xì)胞因子過度表達(dá)引起的大鼠心肌損傷，推測(cè)硒抑制Gadd45α活性，可能是因其化學(xué)預(yù)防活性的表現(xiàn)。今后將從硒對(duì)KD易感性、整體DNA和基因特異性DNA甲基化酶活性和DNA脫甲基酶的活性進(jìn)行研究，以確定硒的預(yù)防作用是否可能是由于改變了DNA甲基化、DNA脫甲基酶和DNA轉(zhuǎn)移酶的活性。

［1］ Hou J，Wang T，Liu M，et al．Suboptimal selenium supply－－a continuing problem in Keshan disease areasin Heilongjiang province［J］．Biol Trace Elem Res，2011，143（3）：1255－1263．

［2］ Asrih M，Steffens S．Emerging role of epigenetics and miRNA in diabetic cardiomyopathy ［J］． Cardiovasc Pathol，2013，22（2）：117－125．

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［4］ Webster AL，Yan MS，Marsden PA．Epigenetics and cardiovascular disease［J］．Can J Cardiol，2013，29（1）：46－57．

［5］ Severin PM，Zou X，Gaub HE，et al．Cytosine methylation alters DNA mechanical properties［J］．Nucleic Acids Res，2011，39（20）：8740－87451．

［6］ Haas J，F(xiàn)rese KS，Park YJ，et al．Alterations in cardiac DNA methylation in human dilated cardiomyopathy［J］．Embo Mol Med，2013，5（3）：413－429．

［7］ Webster AL，Yan MS，Marsden PA．Epigenetics and cardiovascular disease［J］．Can J Cardiol，2013，29（1）：46－57．

［8］ Severin PM，Zou X，Gaub HE，et al．Cytosine methylation alters DNA mechanical properties［J］．Nucleic Acids Res，2011，39（20）：8740－87451．