西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（西安710061） 牟寬厚 李 盼

白癜風是一種常見的原發(fā)性、獲得性皮膚色素脫失性皮膚、粘膜疾病，以大小不等、數(shù)目不定的色素完全脫失斑為典型皮損［1］。目前認為其發(fā)病是多基因遺傳、在多種內(nèi)外因子的激發(fā)下表現(xiàn)為免疫功能紊亂，導致表皮黑素細胞破壞，終至色素脫失［2－4］。目前關于白癜風的研究多集中在黑素細胞上。作為構成皮膚重要組成細胞，角質形成細胞能夠分泌多種細胞因子（IL－1、TNF－α、IL－6、bFGF、ET－1等）從而影響黑素細胞增殖分化。因此角質形成細胞在白癜風的研究上也越來越受關注。高遷移率蛋白B1（HMGB1）是一種核內(nèi)蛋白，其組成性表達于各種組織細胞的胞核內(nèi)，具有多種重要的核內(nèi)功能［5－7］。外源性的HMGB1還能促進人永生化有質形成細胞（HaCaT）增殖。但是HaCaT如何釋放HMGB1尚不清楚。本研究重點討論角質形成細胞如何釋放內(nèi)源性的HMGB1并闡明HMGB1在白癜風發(fā)病中的可能作用及機制。

材料與方法

1 材 料 ①病例資料：10例患者均來自于我科門診近半年來診治的非節(jié)段型白癜風患者，均為男性，年齡35～40歲。且近兩周未用過免疫調(diào)節(jié)劑等藥物?；顧z皮膚組織取自病人的腰腹部，直徑為5mm。7例對照組皮膚組織取自包皮環(huán)切術的正常健康人。②主要試劑：HaCaT細胞系本室常規(guī)保存。兔抗人HMGB1抗體購自Abcam公司，Alexa－488標記的羊抗兔熒光二抗購自Invitrogen公司，兔抗人cleaved caspase3抗體購自 Cell signal公司。Amicon－Ultra－4 10K離心管購自Millipore公司。重組人TNF－α、IFN－γ購自Peprotech公司。

2 方 法 ①細胞培養(yǎng)：HaCaT使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2孵育培養(yǎng)，隔天傳代。②Western－blot檢測 HMGB1釋放：HaCaT細胞（3×106）提前接種于6cm細胞培養(yǎng)皿中，分別使用以下處理方法：TNF－α（20ng／ml）和IFN－γ（40ng／ml）刺激24h；UV照射1min；4μmol／L的喜樹堿處理24h；反復凍融細胞3次誘導壞死。將上清收集后，使用 Amicon－Ultra－4 10K 離心管濃縮上清培養(yǎng)液，使用等體積的上清濃縮液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)過轉膜、5%脫脂牛奶封閉2h后，兔抗人HMGB1（1∶1000）抗體孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育1h。使用化學發(fā)光法，經(jīng)化學發(fā)光儀檢測結果。③免疫熒光染色法檢測白癜風皮膚組織的HMGB1和半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase－3）表達：將白癜風病人的活檢皮膚組織和對照組包皮環(huán)切術的包皮組織4%多聚甲醛固定24h后、20%和30%的蔗糖脫水后，4%多聚甲醛后固定24h。OTC包埋組織，制作10μm的冰凍切片，－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ庖呷旧珪r，使用0．2%的TritonX－100處理10min；漂洗后，10%的山羊血清室溫封閉1h；加入兔抗人的HMGB1抗體（1∶100）或者兔抗人的cleaved caspase－3抗體（1∶400）置于濕盒中4℃過夜；Alexa488標記的山羊抗兔IgG（1∶200）避光置于室溫孵育1h；4＇，6－二脒基－2－苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染色液處理15min；50%甘油封片；共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結果。

結 果

1 損傷的HaCaT細胞可以釋放HMGB1 HaCaT細胞經(jīng)過不同處理后，上清中蛋白經(jīng)過濃縮后經(jīng)檢測均表達HMGB1，在25kD處有明顯條帶。如圖1，凋亡誘導劑喜樹堿誘導細胞凋亡能檢測到HMGB1（泳道3）；紫外線照射（泳道4）、TNF－α和IFN－γ細胞因子刺激（泳道5）、細胞反復凍融（泳道6）皆能誘導凋亡。未處理的培養(yǎng)上清（泳道1）和HaCaT全細胞裂解液（泳道2）作為陰性對照和陽性對照。

圖1 Western－blot檢測HaCaT經(jīng)處理后HMGB1的表達

2 HMGB1在白癜風組織中由細胞核內(nèi)轉移至細胞漿釋放 白癜風皮膚組織及對照皮膚組織經(jīng)過熒光染色，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察HMGB1的表達。如圖2所示：綠色為HMGB1，藍色為細胞核。在正常包皮皮膚中，HMGB1表達在表皮層的角質形成細胞核內(nèi)，與藍色的細胞核共定位。在白癜風皮損區(qū)的皮膚中，HMGB1由細胞核轉移至細胞漿中，部分HMGB1有可能釋放至細胞外。

圖2 免疫熒光檢測HMGB1在正常皮膚和白癜風皮膚中的表達（×400）

3 白癜風皮膚組織中角質形成細胞趨向于凋亡為了證明在白癜風組織中HMGB1由趨向于凋亡的角質形成細胞釋放，我們對于正常皮膚組織和白癜風皮膚組織進行免疫熒光染色，如圖3所示：綠色為cleaved caspase－3，藍色為細胞核。在正常的皮膚中，cleaved caspase－3幾乎沒有表達；而在白癜風皮損區(qū)皮膚角質層，有明顯的cleaved caspase－3表達。

圖3 免疫熒光檢測cleaved caspase－3在正常皮膚和白癜風皮膚中的表達（×400）

討 論

盡管白癜風的發(fā)病機制尚未完全闡明，但現(xiàn)在越來越多的研究表明白癜風是一種自身免疫病，與免疫相關分子有著重要的聯(lián)系［3］。HMGB1作為一種核蛋白，它在受到炎癥刺激時能夠釋放至胞外，它的胞外功能越來越受到重視。角質形成細胞也不單單被認為是一種組成角質層的細胞，多種Toll樣受體，例如TLR2，TLR4等在角質形成細胞表面均有表達［8］，甚至有些文獻認為角質形成細胞是一種特殊的抗原提呈細胞（APC）［9］。本文著重研究角質形成細胞如何釋放HMGB1。HMGB1一般由凋亡的細胞或者壞死的細胞被動釋放或者在受到炎癥刺激時主動分泌。在本研究中，我們使用藥物凋亡誘導劑、紫外線照射、細胞因子刺激、反復凍融等誘導凋亡和壞死，我們發(fā)現(xiàn)HaCaT可以釋放HMGB1。已經(jīng)有文獻報道HaCaT內(nèi)源性表達HMGB1，外源性的HMGB1能夠影響HaCaT的增殖等生物學作用［10］，但是這篇文獻忽視了HMGB1的釋放。恰恰是胞外的HMGB1起著重要的作用。作為警報素分子（alarmin），HMGB1在機體受到損傷時能夠釋放，很有可能結合角質形成細胞表面的Toll樣受體，釋放IL－1和IL－6等細胞因子，介導白癜風的發(fā)生和發(fā)展。

為了證明HMGB1在白癜風中的作用，我們檢測了白癜風組織中HMGB1的表達。實驗結果表明在白癜風的組織中，HMGB1可以由細胞核轉移至細胞漿，可以推斷的是，部分HMGB1已經(jīng)釋放到了胞外發(fā)揮作用。在白癜風的組織中，我們檢測到了代表凋亡的cleaved caspase－3，也證明了在白癜風中，HMGB1是由凋亡的角質形成細胞釋放的。

綜上所述，我們在體外證明了角質形成細胞能夠在凋亡或者壞死的情況下釋放HMGB1；在白癜風組織中，角質形成細胞是趨于凋亡的，能夠釋放HMGB1。接下來的研究將著重闡明在白癜風中HMGB1如 何 通 過 HMGB1－TLR 或 者 HMGB1－RAGE通路發(fā)揮作用。

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