李 林，杜 剛，黃 克，梁紅鎖，唐 俊，李紅波(廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院骨一科，南寧 530031;通訊作者，E-mail:huangke_gx@126.com)

骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是體內(nèi)的一種多功能干細胞，具有自我更新及多向分化潛能，在特定條件下能分化成再生骨、軟骨、肌肉、脂肪、骨髓基質(zhì)等多種組織［1，2］。BMSCs具有低免疫原性，且增殖能力強大，易于從骨髓中分離和體外擴增純化，便于自體移植，近年來被認為有希望成為制備多種組織工程組織的種子細胞來源。

富集血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是通過離心自體全血所得到的血小板濃縮物，富含各類生長因子如血小板衍生因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等。多項研究［3-6］發(fā)現(xiàn)，PRP在體外條件能誘導骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化。PRP誘導分化后的骨髓間充質(zhì)干細胞是否仍然保持低免疫原性?是否還具有免疫調(diào)節(jié)作用?這是涉及同種異體骨髓間充質(zhì)干細胞移植的關鍵問題。本研究旨在探討PRP對骨髓間充質(zhì)干細胞免疫原性的影響，為體內(nèi)試驗提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 L-DMEM培養(yǎng)基(Gibicol公司)、F12-DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(Hyclone公司)、Ficoll淋巴細胞分離液(TBD公司，比重1.077 g/ml)、CD34-PE和 CD45-PE抗體(Santa Cruz公司)、CD105-FITC抗體(BD公司)、RLA-DQ抗體(Abnova公司)、Trizol(Invitrogen公司)、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒及MTS試劑盒(Promega公司)、流式細胞儀(FACSCalibu，BD公司)及細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.1.2 實驗動物 普通級健康新西蘭大耳白兔，雌性，兔齡約為3個月，由山東省農(nóng)科院提供，許可證號:SCXK［魯］20040013。

1.2 方法

1.2.1 家兔來源骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉，以股骨髁突為穿刺點。無菌條件下采集家兔紅骨髓2-5 ml，在華氏管中加入 Ficol1分離液(1.077 g/ml)3 ml，以4℃，3 000 r/min，離心30 min，棄上清，吸中間乳白色樣層細胞，即單個核細胞，F(xiàn)12-DMEM洗滌2遍，棄上清，重懸于含10%FBS的F12-DMEM培養(yǎng)液中，按1×105個/ml接種3 ml于六孔板中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，原代細胞接種48 h后進行首次全量換液，此后每周兩次全量換液，待細胞生長鋪滿至培養(yǎng)板的80%-90%時進行消化傳代，以后細胞按常規(guī)方法傳代、凍存，培養(yǎng)3代后的細胞用于實驗。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導分化 將BMSCs按1×106/孔接種于六孔板中，加入地塞米松(終濃度 0.1 μmol/L)，抗壞血酸磷酸鹽(終濃度0.05 mmol/L)，甘油磷酸鈉(終濃度 10 mmol/L)，分化成熟的成骨細胞以茜素紅染色進行鑒定。

1.2.3 骨髓間充質(zhì)干細胞表型測定 用胰蛋白酶分別消化BMSCs，用PBS調(diào)整細胞密度為1×105個/孔后，分別加入下列鼠抗兔單克隆抗體:CD34-PE，CD45-PE，CD105-FITC，使用直接法標記 CD34和CD45，使用間接法標記CD105，4℃孵育30 min，PBS洗2遍，流式細胞儀檢測BMSCs的細胞表面抗原。

1.2.4 富血小板血漿的獲取以及濃縮成指定體積分數(shù) 3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉，用裝有1 ml枸櫞酸鈉抗凝劑的注射器抽取靜脈血液10 ml，搖勻，置于離心管中，以1 000 r/min的速度離心15 min，吸取全部上清液及交界面以下1-2 mm的紅細胞至另一個離心管，再以3 000 r/min的速度離心8 min，棄上清液上3/4，輕輕振蕩，以獲取血小板血漿。將血小板血漿與激活劑(牛凝血酶及10%的氯化鈣混合物)以9∶1的比例混合、振蕩，4℃冰箱過夜。待血凝塊充分收縮后，重離心10 min，吸取富含復合生長因子的血小板血漿上清液，加入含100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的無血清L-DMEM培養(yǎng)基，分別稀釋成5%和10%兩個體積梯度的富血小板血漿備用。

1.2.5 骨髓間充質(zhì)干細胞與富血小板血漿共培養(yǎng) 將BMSCs細胞以1×106/孔接種于六孔板中，對照組加入200 μl的L-DMEM培養(yǎng)液，實驗組分別加入200 μl含5%和10%PRP的L-DMEM培養(yǎng)液，從而建立起B(yǎng)MSCs與PRP的共培養(yǎng)體系，置37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.6 骨髓間充質(zhì)干細胞RLAⅠ類及RLAⅡ類基因表達 real-time PCR法檢測未分化的BMSCs以及與富集血小板共培養(yǎng)后RLA-Ⅰ(R19)和RLA-Ⅱ(DQA)基因的表達情況。

細胞總RNA提取按Trizol說明書進行操作，取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，引物序列見表1，GAPDH為內(nèi)參基因，實驗在熒光定量PCR儀ABI7500上進行。

表1 骨髓間充質(zhì)干細胞RLAⅠ類及RLAⅡ類基因引物序列Table 1 The primer sequences of RLAⅠand RLAⅡ in BMSCs

1.2.7 骨髓間充質(zhì)干細胞RLA-DR基因表達的測定 取與富集血小板共培養(yǎng)的BMSCs細胞進行試驗，0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞置于含1%牛血清白蛋白的PBS中，洗滌兩次，制成濃度為1×106/ml的單細胞懸液。加入熒光素標記的單克隆抗體:PE-RLA-DR抗體10 μl，避光，冰上孵育45-60 min。流式緩沖液洗滌細胞，并將細胞重懸于PBS，3%多聚甲醛固定，同型對照組加入PE-IgG1消除非特異性熒光，流式細胞儀(FCM)檢測細胞表面分子RLA-DR的表達。

1.2.8 單項混合淋巴細胞反應(MLR)試驗 抽取新鮮兔血，肝素抗凝，PBS等倍稀釋，在華氏管中2∶1加入Ficol1 分離液(1.077 g/ml)，4 ℃，3 000 r/min，離心30 min，棄上清，吸中間乳白色樣層細胞，1 500 r/min，離心10 min，離心2次。加入ddH2O破紅細胞，20 s后立即加入等量PBS終止反應，1 500 r/min離心2次即得淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度為7×105個/ml。

BMSCs長至80%密度時，消化，離心，得到細胞沉淀，濃度調(diào)整為1×106/ml，加入絲裂霉素C(終濃度為25 μg/ml)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為7×105個/ml。

兔外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)與共培養(yǎng)的BMSCs按1∶1進行單向混合淋巴細胞反應，未處理BMSCs作為對照組，5%PRP處理BMSCs作為5%PRP組，10%PRP處理BMSCs作為10%PRP組，同時用2%植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激PBL增殖作為陽性對照。取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔各加入100 μl效應細胞和刺激細胞，每組設三個復孔。置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，共培養(yǎng)72 h。PBL的增殖活性用MTS法測定，具體操作根據(jù)CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay說明書進行，計算出每孔的OD值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)特征及表面抗原

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的BMSCs均一性達到95%以上，膜抗原CD34及CD45呈陰性表達，CD105呈陽性表達，在成骨誘導培養(yǎng)基中的細胞經(jīng)茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)呈紅色(圖1，見第161頁)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定Figure 1 The identification of BMSCs by microscope and flow cytometry

2.2 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞RLA基因表達的影響

real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組 BMSCs相比，5%和10%PRP組BMSCs RLAⅠ類基因(R19)以及RLAⅡ類基因(DQA)表達差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表2)。

表2 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞RLA基因表達的影響 (n=5)Table 2 Effect of PRP on RLA mRNA expression in BMSCs(n=5)

2.3 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞RLA-DR基因表達的影響

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，與對照組BMSCs相比，5%和10%PRP組BMSCs RLA-DR表達差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見圖2)。

圖2 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞RLA-DR基因表達的影響Figure 2 The effect of PRP on RLA-DR gene expression in BMSCs

2.4 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞MLR結(jié)果的影響

MTS試驗結(jié)果顯示，2%PHA可刺激PBL增殖，與對照組BMSCs相比，5%和10%PRP組PBL增殖差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，且BMSCs的存在可抑制PBL增殖(見圖3)。

圖3 富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞MLR結(jié)果的影響 (n=5)Figure 3 Effect of PRP on MLR results in BMSCs(n=5)

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細胞近年引起國內(nèi)外學者關注，除了其強大的體外增殖能力和分化能力外，骨髓MSC免疫原性較小是其重要的原因之一。BMSCs屬于未分化的前體干細胞，其表型分化尚不成熟，因此骨髓BMSCs移植同種異體后無排斥反應或反應較弱。Lazarus等［7］將體外培養(yǎng)擴增的不同濃度骨髓BMSCs通過靜脈注入志愿者體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直至輸入量達到5×107均未發(fā)生明顯的免疫排斥反應，可見BMSCs在臨床同種異體移植方面具有廣闊的應用前景。

同種異體移植中最重要的途徑之一就是靜脈移植。血小板是血液的重要組成，自體全血經(jīng)離心所得到的血小板濃縮物，富含大量的生長因子，如血小板衍生生長因子是多肽生長因子之一，是血小板中釋放的促絲裂原，轉(zhuǎn)化生長因子具有刺激細胞從貼壁依賴性生長轉(zhuǎn)變?yōu)榉琴N壁依賴性生長的多功能細胞生長因子，胰島素生長因子對促進干細胞分化和增殖具有重要作用，這些細胞生長因子為BMSCs生長和分化所必需的［8，9］。分化后的骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫原性是關系到能否把骨髓間充質(zhì)干細胞當做構建組織工程種子細胞的關鍵問題。因此探討PRP誘導分化后BMSCs免疫原性及多種生長因子的干擾下能否保持低免疫原性具有重要的意義。本實驗從家兔RLA基因水平研究證實，與富集血小板血漿共培養(yǎng)后，RLA-Ⅰ(P19)和RLA-Ⅱ(DQA)基因表達水平?jīng)]有顯著性變化。

臨床同種異體移植要求受體與供體具有較低的排斥反應，RLA-DR表型對于供體免疫原性的關系十分密切，關系到移植的成功與否。為研究與PRP共培養(yǎng)后，BMSCs分化后免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，本實驗通過FCM檢測了BMSCs的RLA-DR表型，觀察單向混合淋巴細胞反應，實驗結(jié)果表明骨髓間充質(zhì)干細胞分化后不表達RLA-DR，PRP誘導分化后的BMSCs對PBL沒有明顯的增殖反應。RLA-Ⅱ(DQA)的表達對刺激PBL增殖有著非常重要的作用，盡管分化后BMSCs的RLA-Ⅱ表達輕微增加，可能這種變化較小，不足于改變分化BMSCs的免疫原性。RLA-DR是MHC-Ⅱ類分子的主要抗原之一，與免疫應答密切相關［10］，RLA-DR的表達對刺激PBL增殖也有非常重要的作用。BMSCs經(jīng)PRP誘導分化后，未檢測到RLA-DR表達，表明BMSCs在體外有明顯的抑制刺激細胞增殖的作用。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)，5%和10%兩個體積梯度的富血小板血漿對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)免疫原性的改變都很小，兩組實驗之間沒有顯著性差異，表明富血小板血漿(PRP)對BMSCs的免疫原性不產(chǎn)生影響。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細胞低免疫原性的特性，使其成為在組織工程和細胞治療過程中重要的種子細胞。富血小板血漿含有豐富的生長因子，能誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化和增殖，且不影響其免疫原性，是體外誘導和擴增骨髓間充質(zhì)干細胞的重要材料，但是究竟是其中哪種因子起作用還需要進一步深入研究。

［1］Kalinina NI，Sysoeva VY，Rubina KA，et al.Mesenchymal stem cells in tissue growth and repair［J］.Acta Naturae，2011，3(4):30-37.

［2］張雁云.干細胞免疫學與臨床疾病［J］.現(xiàn)代免疫學，2011，31(3):185-186.

［3］Yazdani SO，Pedram M，Hafizi M，et al.A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat［J］.Tissue Cell，2012，44(4):205-213.

［4］秦靜，趙振林.骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫原性特點及其免疫調(diào)節(jié)能力［J］.現(xiàn)代免疫學，2010，30(6):515-519.

［5］Yoshimi R，Yamada Y，Ito K，et al.Self-assembling peptide nanofiber scaffolds，platelet-rich plasma，and mesenchymal stem cells for injectable bone regeneration with tissue engineering［J］.J Craniofac Surg，2009，20(5):1523-1530.

［6］Lu Y，Li B，Wang X，et al.The effect of programmed cryopreservation on immunogenicity of bladder mucosa in New Zealand rabbits［J］.Cryobiology，2012，64(1):27-32.

［7］Lazarus HM，Haynesworth SE，Gerson SL，et al.Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells(mesenchymal progenitor cells):implications for therapeutic use［J］.Bone Marrow Transplant，1995，16(4):557-564.

［8］Barbet R，Peiffer I，Hutchins JR，et al.Expression of the 49 human ATP binding cassette(ABC)genes in pluripotent embryonic stem cells and in early-and late-stage multipotent mesenchymal stem cells:possible role of ABC plasma membrane transporters in maintaining human stem cell pluripotency［J］.Cell Cycle，2012，11(8):1611-1620.

［9］許茹，夏文杰，戎霞，等.人血小板裂解液替代胎牛血清促進骨髓間質(zhì)干細胞的增殖［J］.南方醫(yī)科大學學報，2011，31(8):1396-1400.

［10］王蘭，盧曉風，李勝富，等.成骨分化的骨髓間充質(zhì)干細胞的免疫原性［J］.華西醫(yī)學，2007，22(4):816-817.