王晶晶，劉慧霞，喬從進(jìn)，景 雅(山西醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，太原 030001;通訊作者，E-mail:jingya66@hotmail.com)

先天性心臟病是最常見的先天性畸形，亦是新生兒期患病和死亡的主要原因之一。在心管發(fā)育早期心肌前體細(xì)胞遷移和分化過程中信號(hào)調(diào)控異?？僧a(chǎn)生較嚴(yán)重的心臟畸形。條件性心臟GATA4基因敲除后的小鼠，可出現(xiàn)心肌細(xì)胞分化不成熟，心腔結(jié)構(gòu)、位置異常等多種畸形［1］。GATA4可以和多種心肌特異性基因的啟動(dòng)子WGATAR序列結(jié)合，促進(jìn)這些基因在心肌和心肌前體細(xì)胞的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄［2］。轉(zhuǎn)錄因子GATA4、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)可用來(lái)標(biāo)記心肌細(xì)胞的早期分化［3-4］，本實(shí)驗(yàn)用兩種蛋白標(biāo)記來(lái)觀察小鼠早期心管形態(tài)結(jié)構(gòu)，探討心肌細(xì)胞的遷移和分化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80日齡20只質(zhì)量均勻健康的中國(guó)昆明小鼠經(jīng)體染標(biāo)記后于明暗周期條件下規(guī)律飼養(yǎng)。2周后，將雌、雄小鼠于晚6∶00合籠，次晨7∶00檢查陰栓，有陰栓者記為妊娠0.5 d，妊娠小鼠乙醚麻醉后取材，收集7.5-9 d的小鼠胚胎連同子宮各6只。胚胎連同子宮于固定液中固定24 h，固定液的配制為甲醇∶丙酮∶水 =2∶2∶1(體積比)混勻。

1.2 胚胎連同子宮的包埋

標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟后包埋。包埋要領(lǐng):子宮的系膜緣朝向包面框內(nèi)，對(duì)系膜緣正對(duì)包埋框壁。子宮兩斷端連線與包埋框長(zhǎng)邊平行。冷卻修塊后制作8 μm厚連續(xù)石蠟切片，鋪于載玻片上。切片注意事項(xiàng):切蠟塊方向始終為從子宮的一側(cè)斷端到另一側(cè)斷端。

1.3 染色

切片脫蠟，水化后經(jīng)3%過氧化氫和TENG-T(10 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl，0.25%gelatin，0.05%Tween-20;pH=8.0)(pH7.4 PBS配制)預(yù)處理半小時(shí)，以減低內(nèi)源性過氧化物酶的活性和非特異性染色。連續(xù)切片進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色所用的抗體為抗轉(zhuǎn)錄因子GATA4多克隆抗體(1∶50，武漢博士德生物工程有限公司)、抗α-SMA抗體(1∶1 000，Sigma公司，美國(guó))。

2 結(jié)果

小鼠胚胎發(fā)育7.5 d，位于神經(jīng)溝腹側(cè)的生心區(qū)域?yàn)樯陌?，原始心管尚未融?圖1A，見第159頁(yè))。位于神經(jīng)溝和原腸之間以及原腸周圍的細(xì)胞體積較大，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間有突起相連，處于低分化狀態(tài)，此為中胚層間充質(zhì)細(xì)胞(圖1B，見第159頁(yè))?？拷膮^(qū)的間充質(zhì)細(xì)胞分為兩部分，靠近內(nèi)側(cè)的間充質(zhì)細(xì)胞與生心板相延續(xù)，靠近外側(cè)的間充質(zhì)細(xì)胞與心包腔的臟壁中胚層相接(圖1B，見第159頁(yè))。心肌早期分化標(biāo)記蛋白α-SMA在生心板有較強(qiáng)表達(dá)(圖1C，見第159頁(yè))。

小鼠胚胎發(fā)育8 d，原始心管從中間向兩邊開始融合，在正中矢狀切面上不可見間充質(zhì)細(xì)胞與原始心管相延續(xù)(圖2，見第159頁(yè))。小鼠胚胎發(fā)育8.5 d，原始心管中部融合的部位明顯變長(zhǎng)，未融合的頭、尾端變短(圖3，見第159頁(yè))。神經(jīng)溝與原腸之間及原腸周圍的間充質(zhì)細(xì)胞顯著增多，同樣可見與原始心管及心包腔臟壁中胚層相連接(圖3，見第159頁(yè))。

小鼠胚胎發(fā)育9 d，原始心管各部生長(zhǎng)速度不同步，使得心管表面出現(xiàn)膨出和溝(圖4Α箭頭，見第160頁(yè))。在尾端可見壁較薄的血管與心管相連。血管內(nèi)可見造血干細(xì)胞，有的處于分裂狀態(tài)(圖4Α橢圓，見第160 頁(yè))。7.5 d，8 d，8.5 d，9 d 四個(gè)時(shí)期的胚胎都可見到多種切面(圖1-4，見第159，160頁(yè))。免疫組織化學(xué)染色心肌早期分化的蛋白在生心板或原始心管上都有較強(qiáng)表達(dá)(圖1C，2B，3B，4B，見第159，160 頁(yè))。

圖1 胚齡7.5 d心臟橫切面Figure 1 Transversal sections of the mouse embryonic heart at ED7.5

圖2 胚齡8d心臟矢狀切面 (bar=250 μm)Figure 2 Sagittal sections of the mouse embryonic heart at ED8 (bar=250 μm)

圖3 胚齡8.5 d心臟橫斷面 (bar=250 μm)Figure 3 Transversal sections of the mouse embryonic hearts at ED8.5 (bar=250 μm)

圖4 胚齡9 d心臟冠狀切面 (bar=250 μm)Figure 4 Coronal sections of the mouse embryonic hearts at ED9 (bar=250 μm)

3 討論

心臟的發(fā)育經(jīng)歷了復(fù)雜的形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)重建過程，并受到多種轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)［5-8］。心臟發(fā)育早期，原始生心中胚層形成后，隨著胚盤側(cè)褶的形成兩側(cè)生心中胚層在胚胎腹側(cè)中線融合，形成了原始心管。原始心管背側(cè)，神經(jīng)溝和原腸之間以及原腸周圍的間充質(zhì)細(xì)胞為頭端的胚胎中胚層間充質(zhì)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)心包腔臟壁中胚層細(xì)胞和心管中胚層細(xì)胞都與此區(qū)域的間充質(zhì)細(xì)胞相延續(xù)，提示兩者來(lái)源相同，即都為頭端胚胎中胚層間充質(zhì)細(xì)胞遷移分化形成。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)8 d前小鼠胚胎原始心管研究發(fā)現(xiàn)，心肌早期分化標(biāo)志蛋白轉(zhuǎn)錄因子GATA4、α-SMA于生心板或心管的部位強(qiáng)表達(dá)，而心包腔臟壁中胚層部位呈陰性，說(shuō)明雖然兩者來(lái)源相同，但在胚胎發(fā)育過程中，心包腔臟壁中胚層和原始心管受到了不同的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，向不同的方向分化。胚胎中胚層間充質(zhì)細(xì)胞可遷移并分化成多種細(xì)胞［9-10］。我們推測(cè)，位于人體頭端神經(jīng)溝和原腸之間的間充質(zhì)細(xì)胞向腹側(cè)遷移至心管和心包腔臟壁中胚層后，再分化成兩種不同的細(xì)胞，同時(shí)失去遷移能力。心包部位細(xì)胞最后分化形成上皮組織而心管部位的細(xì)胞分化形成心肌組織。Watt等［1］的實(shí)驗(yàn)是關(guān)于GATA4基因敲除后出現(xiàn)心臟畸形的研究，研究的是異常形態(tài)，而我們觀察了GATA4蛋白在正常原始心管發(fā)生過程中的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，為闡明GATA4基因敲除后出現(xiàn)的心臟畸形機(jī)制提供組織學(xué)依據(jù)。我們從胚胎心臟矢狀切面上觀察到生心板或原始心管中間部分不與胚胎中胚層間充質(zhì)細(xì)胞相延續(xù)，提示心臟發(fā)育早期間充質(zhì)從兩側(cè)向心管遷移。

另外，我們發(fā)現(xiàn)四個(gè)時(shí)期的胚胎都可見到多種切面并且切面是隨機(jī)的。前期切片方向固定即始終為從子宮的一側(cè)斷端切至另一側(cè)斷端。這說(shuō)明早期胚胎在子宮內(nèi)的體位是不固定的，體位的轉(zhuǎn)動(dòng)無(wú)規(guī)律。剝離出的胚胎可隨意選擇切面，小胚齡胚胎從子宮中剝離并保證胚胎的完整性較困難，需連同子宮一起固定，不能保證切面的隨意選擇。比如心臟橫斷面更能看清心臟結(jié)構(gòu)及與周圍結(jié)構(gòu)關(guān)系，要得到更多的橫斷面就得嘗試多種切面，同剝離出的胚胎只做一種切面得不到預(yù)期結(jié)果。

［1］Watt AJ，Battle MA，Li JX，et al.GATA4 is essential for formation of the proepicardium and regulates cardiogenesis［J］.Science，2004，101(34):12573-12578.

［2］Pikkarainen S，Tokola H，Kerkel R，et al.GATA transcription factors in the developing and adult heart［J］.Cardiovasc Res，2004，63:196-207.

［3］Sepulveda JL，Belaguli N，Nigam V，et al.GATA-4 and Nkx-2.5 coactivate Nkx-2 DNA binding targets:role for regulating early cardiac gene expression［J］.Mol Cell Biol，1998，18(6):3405-3415.

［4］Sugi Y，Lough J.Onset of expression and regional deposition of alpha-smooth and sarcomeric actin during avian heart development［J］.Dev Dyn，1992，193:116-124.

［5］Satou Y，Satoh N.Gene regulatory networks for the development and evolution of the chordate heart［J］.Genes Dev，2006，20:2634-2638.

［6］Stennard FA，Harvey RP.T-box transcription factors and their roles in regulatory hierarchies in the developing heart［J］.Development，2005，132:4897-4910.

［7］Black BL.Transcriptional pathways in second heart field development［J］.Semin Cell Dev Biol，2007，18(1):67-76.

［8］Sachinidis A，F(xiàn)leischmann BK，Kolossov E，et al.Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells［J］.Cardiovasc Res，2003，58:278-291.

［9］Theveneau E，Mayor R.Neural crest delamination and migration:from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration［J］.Dev Biol，2012，366(1):34-54.

［10］Malinda KM，Ettensohn CA Primary mesenchyme cell migration in the sea urchin embryo:distribution of directional cues［J］.Dev Biol，1994，164(2):562-578.