徐俊，雍曉雨，費(fèi)文斌，周俊，2，王舒雅，2，陳怡露，鄭濤，2

1(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京，211816)

2(南京工業(yè)大學(xué) 生物能源研究所，江蘇南京，211816)

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)是一種顯色劑，能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞(酵母，細(xì)菌，植物細(xì)胞等)發(fā)生呈色反應(yīng)。TTC本身為無(wú)色，但能被活細(xì)胞中的呼吸鏈脫氫酶將無(wú)色的氧化態(tài)TTC還原為紅色的TTF(Triphenyl formazan)［1］。TTF存在于細(xì)胞內(nèi)，且不溶于水，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取，在一定波長(zhǎng)下其吸光值的大小反映了細(xì)胞膜電子傳遞鏈遞氫能力的大小。且細(xì)胞內(nèi)TTC反應(yīng)所呈現(xiàn)的紅色的深淺反映了其生命活力的強(qiáng)弱，顏色越深表明其活力越強(qiáng)。由于TTC的上述特點(diǎn)，TTC染色法被廣泛應(yīng)用于種子、微生物細(xì)胞呼吸活性［2-4］等的檢測(cè)，例如Ogur等用TTC篩選酵母的呼吸缺陷株［5］;劉華等人利用TTC法測(cè)定紅豆杉細(xì)胞活力［6］;王躍華等人利用TTC法測(cè)定滇重樓細(xì)胞活力并優(yōu)化測(cè)定條件［7］;楊天佑等人利用TTC-脫氫酶測(cè)定法研究低溫真空環(huán)境對(duì)細(xì)菌呼吸活性的影響［8］。TTC染色法也被應(yīng)用于高產(chǎn)乙醇酵母的篩選［9-10］。在酵母細(xì)胞中，乙醇發(fā)酵的主要途徑包括葡萄糖酵解和丙酮酸的無(wú)氧降解，在此過(guò)程中糖-乙醇轉(zhuǎn)化酶起主要作用，TTC能對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過(guò)其顏色的深淺可以判斷其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活力的大小，顏色越深表明其細(xì)胞活性越強(qiáng)，產(chǎn)乙醇能力也越強(qiáng)［11］。

現(xiàn)有的篩選高產(chǎn)乙醇酵母的方法還存在較多缺陷。第1是含有TTC培養(yǎng)基的平板制作復(fù)雜，接種酵母后生長(zhǎng)比較緩慢，并且后續(xù)挑取顏色較深的酵母時(shí)，操作也比較繁瑣，需時(shí)較長(zhǎng);第2是利用人眼觀測(cè)通過(guò)TTC染色法的呈色反應(yīng)后顏色的深淺來(lái)判斷細(xì)胞活力從而預(yù)測(cè)酵母產(chǎn)乙醇能力的高低，由于待篩選細(xì)胞繁多，很容易產(chǎn)生疲勞和誤差，影響細(xì)胞篩選的準(zhǔn)確度和效率。本實(shí)驗(yàn)探索利用TTC染色法和96孔板培養(yǎng)酵母細(xì)胞，通過(guò)酶標(biāo)儀在一定波長(zhǎng)下檢測(cè)，定量、快速、可靠地直接反應(yīng)細(xì)胞活力，能夠顯著降低篩選時(shí)間及降低操作過(guò)程中的視覺(jué)判斷產(chǎn)生的人為誤差。

1 材料與方法

1.1 菌株

酵母菌株#1-#23(共23 株)，J-10，J-19，J-27，OY-11(由本實(shí)驗(yàn)室保藏)。

1.2 培養(yǎng)基

YPD斜面培養(yǎng)基:1 L培養(yǎng)基含10 g酵母粉，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉。

YPD液體培養(yǎng)基:1 L培養(yǎng)基含10 g酵母粉，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖。

1.3 酵母細(xì)胞活力檢測(cè)方法的建立

1.3.1 有機(jī)溶劑選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，需選擇價(jià)格低廉、萃取效果好、毒性較低、并且對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板無(wú)腐蝕性的有機(jī)溶劑作為萃取劑。將培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞菌液分別加入1 mL乙酸乙酯、甲醇、丙酮、二甲基亞砜，振蕩后離心，取200 μL上清液加入酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其TTF吸收值。

1.3.2 有機(jī)溶劑最佳濃度的選擇

取1 mL在含有TTC的培養(yǎng)液中培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞菌液10 000 r/min離心1 min后棄上清液，加入1 mL不同體積分?jǐn)?shù)的二甲基亞砜溶液(100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%)，充分混勻后10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其TTF吸收值。

1.3.3 TTF最大吸收波長(zhǎng)的確定

取1 mL培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞液，10 000 r/min離心1 min后棄上清液。加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為85%的二甲基亞砜溶液，振蕩后離心機(jī)10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，檢測(cè)TTF吸收值，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為200～1 000 nm，步長(zhǎng)為1 nm。

1.3.4 TTF 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［7，12］

分別取 1 mL 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 g/L的TTC溶液加入10 mL離心管中，加入2 mL pH8.4 Tris-HCl和1 mL 10 g/L的Na2S2O4溶液，37℃水浴振蕩5 min(以上步驟均在暗處操作)，使得TTC完全還原為T(mén)TF。將上述反應(yīng)液10 000 r/min離心10 min后棄上清液，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為85%的二甲基亞砜溶液并充分混勻，于486 nm處測(cè)吸光值，并以此為縱坐標(biāo)，以TTC濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 培養(yǎng)體系中TTC濃度的確定

設(shè)置YPD培養(yǎng)基中TTC質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L。將培養(yǎng)好的酵母種子液按10%的接種量分別接入含有以上TTC濃度的YPD培養(yǎng)基中，200 r/min 30℃培養(yǎng)12 h。分別取1 mL培養(yǎng)好的菌液，10 000 r/min離心1 min后棄上清液，再分別加入1 mL二甲基亞砜溶液，充分混勻后10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其TTF吸收值。

1.3.6 培養(yǎng)液pH的確定

設(shè)置YPD培養(yǎng)基中pH分別為1～14，將培養(yǎng)好的酵母種子液按10%的接種量分別接入以上pH的YPD培養(yǎng)基中，200 r/min 30℃培養(yǎng)12 h。分別取1 mL菌液10 000 r/min離心1min，棄上清液，再分別加入1 mL二甲基亞砜溶液，充分混勻后10 000 r/min離心1 min，取200 μL上清液加入酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其TTF吸收值。

1.3.7 待檢測(cè)酵母細(xì)胞培養(yǎng)

取100 μL待檢測(cè)酵母細(xì)胞菌液涂布于YPD固體平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后挑取單菌落轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入150 μL的YPD培養(yǎng)液，并設(shè)置最終體積分?jǐn)?shù)為0、10%、14%的乙醇，30℃ 200 r/min培養(yǎng)4 h后，測(cè)定其OD600值。將上述酵母細(xì)胞培養(yǎng)液4 000 r/min離心5 min后棄上清液，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入150 μL體積分?jǐn)?shù)為85%的二甲基亞砜溶液，振蕩15 s后4 000 r/min離心5 min待測(cè)。添加不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，是為了檢測(cè)在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下待測(cè)菌株的細(xì)胞活力，這樣既可以用該方法檢測(cè)同一株菌在有無(wú)乙醇及乙醇體積分?jǐn)?shù)高或低的處理下細(xì)胞活力，還可以檢測(cè)并比較不同菌株在同一乙醇體積分?jǐn)?shù)下的活力，以此選擇耐乙醇的菌株。

1.3.8 TTF值的測(cè)定

吸取100 μL上述細(xì)胞培養(yǎng)板中振蕩離心后的上清液到96孔酶標(biāo)板中，在486 nm下測(cè)定TTF吸收值，根據(jù)TTF標(biāo)準(zhǔn)曲線及步驟1.3.2中測(cè)定的細(xì)胞OD600值，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)TTF含量，計(jì)算公式為:TTF含量=實(shí)驗(yàn)測(cè)得TTF吸收值×(1/細(xì)胞OD600吸收值)，以所得到的在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)的TTF值確定細(xì)胞呼吸力即細(xì)胞活力大小。TTF含量越高，表明細(xì)胞活力越強(qiáng)。

1.3.9 各菌株乙醇產(chǎn)量的測(cè)定

使用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定各株菌株的乙醇產(chǎn)量。選用SGE 30QC2/AC20-0.25毛細(xì)管柱，柱箱溫度60℃，進(jìn)樣器溫度190℃，檢測(cè)器溫度240℃，內(nèi)標(biāo)物為正丙醇，檢測(cè)液為6%正丙醇溶液與被測(cè)樣品混合液，檢測(cè)液配置方法:取0.5 mL 6%正丙醇溶液和0.5 mL被測(cè)樣品加入10mL容量瓶，加水定容至10 mL，測(cè)定時(shí)檢測(cè)液進(jìn)樣量為2 μL。通過(guò)氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定各株菌的乙醇產(chǎn)量后，通過(guò)各株菌對(duì)應(yīng)的胞內(nèi)TTF值，確定TTF值與乙醇產(chǎn)量的關(guān)系，最后篩選出具有較強(qiáng)活力的菌株。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法中實(shí)驗(yàn)參數(shù)的確定

2.1.1 有機(jī)溶劑選擇

表1為二甲基亞砜等所選4種有機(jī)溶劑的胞內(nèi)TTF提取效果比較。首先所選用的有機(jī)溶劑必須能夠最大程度地提取出胞內(nèi)所形成的TTF結(jié)晶。由表1可知，用二甲基亞砜提取TTF結(jié)晶時(shí)，其上清液中TTF吸收值達(dá)到1.127，分別為使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯時(shí)的1.19、1.55、1.80倍，在3種有機(jī)溶劑中效果最好。同時(shí)，考慮到有機(jī)溶劑對(duì)于96孔酶標(biāo)板的腐蝕性，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。相比于其他3種有機(jī)溶劑，二甲基亞砜對(duì)96孔酶標(biāo)板無(wú)腐蝕性，在酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)，所測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信。而且，二甲基亞砜?jī)r(jià)格較低，相比于其他幾種有機(jī)溶劑毒性較低。經(jīng)綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選用二甲基亞砜作為T(mén)TF提取劑。

表1 有機(jī)溶劑提取胞內(nèi)TTF效果比較Table 1 Comparison of intracellular TTF extracted by organic solvent

2.1.2 有機(jī)溶劑最佳濃度的選擇

二甲基亞砜最佳濃度的選擇結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，體積分?jǐn)?shù)為100% ～85%的二甲基亞砜提取TTF結(jié)晶，上清液TTF吸收值都達(dá)到1.15左右，效果基本相當(dāng)。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，吸收值為1.109，有一定程度的下降。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)低于80%時(shí)，TTF吸收值有很明顯的下降，且隨二甲基亞砜濃度的降低而降低，故實(shí)驗(yàn)中選用體積分?jǐn)?shù)為85%的二甲基亞砜溶液。

表2 不同稀釋比例二甲基亞砜提取效果比較Table 2 Comparison of the extraction effect of different dilution ratio dimethyl sulfoxide

2.1.3 TTF最大吸收波長(zhǎng)的確定

全波長(zhǎng)掃描圖譜見(jiàn)圖1。由圖1可知，在486 nm處TTF有一明顯的吸收峰，故本實(shí)驗(yàn)選用486 nm作為T(mén)TF吸收峰的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.4 TTF標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 TTF的全波長(zhǎng)掃描Fig.1 Absorbance spectrum of TTF

按照1.3.1章節(jié)所述準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的反應(yīng)液，并以混合液于486 nm處吸光值為縱坐標(biāo)，TTC濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.000 9+14.72X，R2=0.995 6。當(dāng) TTC濃度在0.01% ～0.06%時(shí)，OD值在0.15～0.88，兩者呈較好的線性關(guān)系，可以用于定量測(cè)定。當(dāng)OD值低于0.15或者高于0.88時(shí)，即認(rèn)為超出可信區(qū)間，在此基礎(chǔ)上測(cè)得的值認(rèn)為不可取。標(biāo)準(zhǔn)曲線是為了檢測(cè)細(xì)胞生成的TTF值落在一個(gè)可信的區(qū)間內(nèi)，不在這個(gè)區(qū)間的認(rèn)為這個(gè)值不可信。

2.1.5 培養(yǎng)體系中TTC濃度的確定

由圖2可知，在TTC濃度為0.4%時(shí)所測(cè)的TTF的吸收值最高，超過(guò)這一濃度后TTF吸收值下降。這是由于TTC本身具有一定的毒性，過(guò)高的TTC濃度本身對(duì)細(xì)胞活性有一定的影響，溶液中積累TTC濃度越高，對(duì)細(xì)胞活性影響越大，細(xì)胞生長(zhǎng)越慢，即細(xì)胞OD值越低。0.05% ～0.2%時(shí)測(cè)得的TTF吸收值偏低，原因可能是由于溶液中TTC的含量太少，不足以測(cè)得培養(yǎng)液中所有酵母群體的活性。因此，本實(shí)驗(yàn)選定反應(yīng)體系中的TTC濃度為0.4%。

圖2 TTC濃度對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of TTC concentration on the yeast culture

2.1.6 培養(yǎng)液pH的確定

由圖3可知，反應(yīng)液的pH ＜6時(shí)，測(cè)得的TTF吸收值很小，當(dāng)反應(yīng)液的pH在8～9時(shí)，所測(cè)得TTF吸收值較大，其中在pH為8時(shí)測(cè)得TTF吸收值最大。當(dāng)pH ＞10時(shí)，所測(cè)得吸收值很小。其原因有:當(dāng)pH值較低時(shí)，由于細(xì)胞處于較為不適的生長(zhǎng)pH環(huán)境，所以生長(zhǎng)較為緩慢，測(cè)得的細(xì)胞OD值也較低。當(dāng)pH在中性微偏堿環(huán)境下時(shí)，酵母細(xì)胞處于較為適應(yīng)的生長(zhǎng)環(huán)境，其生長(zhǎng)較快，且有最大活性，因此，測(cè)得細(xì)胞OD值也較高。當(dāng)pH值超過(guò)10時(shí)，堿性環(huán)境不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，隨pH值降低，生長(zhǎng)速度減慢，其細(xì)胞OD值也較低。故實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)體系的pH值應(yīng)控制在pH 8左右。

圖3 培養(yǎng)液pH對(duì)酵母活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of yeast

2.2 酵母活性及乙醇產(chǎn)量檢測(cè)

根據(jù)1.3建立的檢測(cè)方法以及乙醇產(chǎn)量檢測(cè)方法，從本實(shí)驗(yàn)室保藏的27株菌株中篩選出具有較強(qiáng)活力的6株菌株，按細(xì)胞活力強(qiáng)弱依次排列為#5，#1，#8，OY-11，#7，#6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 酵母菌株活性及乙醇產(chǎn)量情況Table 3 Cell activity and ethanol yield of yeast strains

從表3中可以看出:在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%，10%，14%時(shí)，菌株#5 TTF吸收值均為最高，分別達(dá)到0.819、0.795、0.365。菌株#5相比于其他5株菌，在有無(wú)乙醇?jí)毫η闆r下都具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)，可見(jiàn)其活性在測(cè)試的所有菌株中最強(qiáng)，其他菌株按活性強(qiáng)弱依次為#1，#8，OY-11，#7，#6。同時(shí)測(cè)定菌株乙醇產(chǎn)量，菌株#5的乙醇產(chǎn)量也為最高，達(dá)到5.87 g/L，其他菌株按乙醇產(chǎn)量高低依次為#8，#1，OY-11，#7，#6。乙醇發(fā)酵過(guò)程中糖-乙醇轉(zhuǎn)化酶起主要作用，TTC能對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，通過(guò)其顏色的深淺可以判斷其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活力的大小。顏色越深，表明TTC在酵母胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為T(mén)TF結(jié)晶含量越高，既TTF吸收值較高，同時(shí)也可表明其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性越強(qiáng)，細(xì)胞活性也越強(qiáng)，而轉(zhuǎn)化酶活力的強(qiáng)弱與乙醇產(chǎn)量有關(guān)。酶活越高，產(chǎn)乙醇能力也越強(qiáng)。菌株#5在乙醇?jí)毫?%，10%，14%時(shí)都具有最高的TTF吸收值，也就表明其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化酶活性在所有菌株中最強(qiáng)，乙醇產(chǎn)量也最高，通過(guò)表3中乙醇產(chǎn)量可以看出，#5菌株比其他菌株高出5%左右。通過(guò)分析其他菌株的TTF吸收值與乙醇產(chǎn)量可以看出，TTF值下降，細(xì)胞活性降低，乙醇產(chǎn)量也有一定程度下降。由此得出，菌株的細(xì)胞活力與乙醇產(chǎn)量在一定程度上是成正相關(guān)的。

相比于原有研究中，王躍華等人報(bào)道TTC-脫氫酶還原法能夠檢測(cè)滇重樓地下莖的細(xì)胞活力，其目標(biāo)為檢測(cè)細(xì)胞活性，而本研究所發(fā)明的TTC染色法用于酵母菌細(xì)胞活性的測(cè)定，使用96孔板及酶標(biāo)儀快速檢測(cè)多株酵母，且最終目標(biāo)定位于能夠通過(guò)比較TTF生成量與乙醇產(chǎn)量關(guān)系來(lái)篩選高產(chǎn)乙醇酵母菌株，同時(shí)，本研究所建立的方法中，TTC工作濃度僅為0.4%，僅為前人報(bào)道的1/2，因此，本方法具有準(zhǔn)確、高效、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)為85%二甲基亞砜作為T(mén)TF最佳提取劑，培養(yǎng)液中TTC濃度為0.4%，溶液pH8，TTF最大吸收波長(zhǎng)為486 nm。通過(guò)檢測(cè)待測(cè)菌株在上述條件下培養(yǎng)后所測(cè)得的TTF吸收值，以及細(xì)胞OD值，可以通過(guò)公式TTF含量=實(shí)驗(yàn)測(cè)得TTF吸收值×(1/細(xì)胞OD600吸收值)，計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)實(shí)際TTF值，以所得到的在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)的TTF值確定細(xì)胞呼吸力即細(xì)胞活力大小。同時(shí)，測(cè)定待測(cè)菌株所對(duì)應(yīng)的乙醇產(chǎn)量，可以得到細(xì)胞呼吸活力與乙醇產(chǎn)量的關(guān)系，即酵母呼吸活力與其乙醇產(chǎn)量在一定程度上呈正相關(guān)。

(2)本實(shí)驗(yàn)所建立的基于TTC染色法的高活力酵母細(xì)胞定量篩選方法，相比于原有一些對(duì)于利用TTC染色法篩選酵母的研究中雖利用96孔板但沒(méi)有明顯減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間，以及在利用96孔板僅僅是對(duì)細(xì)胞群體密度的定量等相比，本方法具有準(zhǔn)確性、高效性、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。

(3)本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可應(yīng)用于高活性、高產(chǎn)乙醇酵母的篩選，也可用于其他微生物及植物細(xì)胞的活性檢測(cè)，為快速、大量檢測(cè)細(xì)胞活性提供一條新途徑。

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