侯強(qiáng)川，郭壯 ，張家超，孫天松

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特，010018)

發(fā)酵蔬菜是以蔬菜為原料，通過自然發(fā)酵或人工接種益生菌發(fā)酵的方式得到的一大類食品，其產(chǎn)品主要包括泡菜、酸菜、醬菜、腌菜等。發(fā)酵蔬菜不僅保留了蔬菜原來的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)在有益微生物的作用下，其還能產(chǎn)生多種人體必須的氨基酸和脂肪酸，增加了蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，延長(zhǎng)了蔬菜的保質(zhì)期。

既往研究表明，乳酸菌對(duì)于發(fā)酵蔬菜的發(fā)酵成熟起著至關(guān)重要的作用［1-3］，分離篩選品質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌菌株是發(fā)酵蔬菜工業(yè)化生產(chǎn)所必不可少的。除此之外，發(fā)酵蔬菜中微生物的種類和數(shù)量對(duì)發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味和質(zhì)量具有極其重要的影響［4］。全面深入地分析發(fā)酵蔬菜中微生物的多樣性和菌群組成對(duì)于掌握發(fā)酵蔬菜風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生和變化規(guī)律，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生成機(jī)理以及科學(xué)地預(yù)測(cè)產(chǎn)品保質(zhì)期具有重要的意義。

傳統(tǒng)檢測(cè)發(fā)酵蔬菜中微生物組成最常用的是基于純培養(yǎng)的方法，但受培養(yǎng)條件的限制，該方法并不能完全揭示產(chǎn)品中微生物菌群的組成。之前有研究表明，自然界中只有不到1%的微生物可培養(yǎng)［5］，這表明單純以純培養(yǎng)的方式研究發(fā)酵蔬菜中微生物的組成，結(jié)果往往是低估了產(chǎn)品中微生物的多樣性。伴隨分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的基于非培養(yǎng)的微生物檢測(cè)方法和技術(shù)如DGGE/TGGE技術(shù)、克隆文庫分析法、SSCP技術(shù)、基因芯片技術(shù)等被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜微生物檢測(cè)中。這些新技術(shù)的使用使人們對(duì)于自然界中99%以上不可培養(yǎng)微生物的研究成為可能。隨著羅氏454公司新一代高通量焦磷酸測(cè)序儀的面世，我們獲得了一種全新認(rèn)識(shí)微生物世界的途徑，454焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序通量大、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，近年來該技術(shù)在各類食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣泛，如奶酪［6-7］，開菲爾［8-9］，酒精飲料［10］等發(fā)酵食品。

本研究以采集自俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)埃利斯塔市郊的2份發(fā)酵蔬菜為研究對(duì)象，通過純培養(yǎng)的方法結(jié)合16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)其中分離出的乳酸菌進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定和分型，同時(shí)采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析了樣品中細(xì)菌構(gòu)成的多樣性。以期為發(fā)酵蔬菜工業(yè)化生產(chǎn)菌株的篩選做前期菌株儲(chǔ)備，同時(shí)也為全面掌握發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌的組成和改進(jìn)發(fā)酵蔬菜的制作工藝提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)的2份發(fā)酵蔬菜樣品Ru12、Ru13采集自俄羅斯埃利斯塔市郊，MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、10%脫脂乳培養(yǎng)基等參照文獻(xiàn)［11-13］制備，M17固體培養(yǎng)基(CM0785B)和M17液體培養(yǎng)基(CM0817B)由英國(guó)OXOID公司提供，PCR引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。Taq酶(DR001C)由寶生物工程(大連)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

表1 實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器Table 1 The main equipment in this study

1.3 菌株培養(yǎng)分離及鑒定方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

無菌條件下，用滅菌槍頭吸取500 μL發(fā)酵液于4.5 mL的生理鹽水(0.85%，w/v)中，以十倍稀釋法對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋后，吸取200 μL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液涂布于已準(zhǔn)備好的M17和MRS固體平板培養(yǎng)基上。將涂布的平皿放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中(氣體條件:CO2∶H2∶N2=10∶10∶80)，并置于 30 ℃培養(yǎng)48～72 h，菌落形成后觀察其形態(tài)。依據(jù)之前報(bào)道中乳酸菌的菌落形態(tài)特征，將疑似為乳酸菌的菌落做標(biāo)記，并在無菌操作臺(tái)中用接種針或接種環(huán)挑取標(biāo)記好的菌落分別相應(yīng)接種于MRS和M17液體培養(yǎng)基中，30℃厭氧培養(yǎng)24 h。繼續(xù)傳代后挑取適量菌體進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)(涂片、固定、染色、脫色)，在顯微鏡下仔細(xì)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)和細(xì)菌排列方式。將革蘭氏染色陽性的菌株暫定為乳酸菌［14］，并進(jìn)一步純化培養(yǎng)保存。

1.3.2 乳酸菌基因組DNA提取及16S rRNA測(cè)序

將純化好的菌株采用CTAB法提取總DNA［15］。并利用PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因片段。擴(kuò)增引物采用通用引物:

正向引物為27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;

反向引物為1495R:5'-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3’。

PCR反應(yīng)體系見表2:

表2 PCR反應(yīng)體系(25μL)Table 2 PCR reaction system(25μL)

取5 μL PCR產(chǎn)物和2 μL上樣緩沖液(6×Loading Buffer)混合，采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電壓5 V/cm，電泳液為0.5×TBE。電泳30 min后用凝膠成像儀觀察結(jié)果，片段長(zhǎng)度約1 500bp的陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定的序列用BLAST在GenBank中搜索相近序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。將測(cè)序菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列首先使用ClustalX［16］將序列進(jìn)行完全比對(duì)，如果菌株與模式菌株的同源性大于99%，則可鑒定此菌株與模式菌株為同一菌株，然后用Neighbor-joining法［17］取得序列的進(jìn)化距離。使用MEGA5軟件［18］作出系統(tǒng)進(jìn)化樹，數(shù)據(jù)自展重抽樣次數(shù)1 000次。所得菌株16S rRNA序列全部提交GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.4 454焦磷酸測(cè)序材料的獲取和數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 基因組DNA提取

采用破碎法提取2份樣品中基因組DNA。具體步驟如下:將采集的原始樣品在漩渦振蕩器上振蕩30 s混勻，取800 μL樣品于1.5 mL滅菌 EP管中。12 000 g離心10 min，棄去上清液，沉淀中加1 mL PBS緩沖液，漩渦振起。12 000 g離心10 min，棄去上清，沉淀加800 μL Tris-EDTA緩沖液，漩渦振勻后轉(zhuǎn)至裝有玻璃珠的破碎管中，在破碎儀上破碎3次。在破碎液中加入60 μL SDS，振勻后在4℃放置5 min。12 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的1.5 mL滅菌 EP管中。加入100 μL NaCl溶液(5 mol/L)，80 μL CTAB(1%，pH=8.0)，65 ℃水浴 20 min。加 V(酚)∶V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=25∶24∶1至約1.5 mL處，顛倒混勻，靜置1 min，重復(fù)3次。4℃，12 000 g離心10 min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL滅菌EP管中，加入等體積的三氯甲烷異戊醇，室溫12 000 g離心5 min。收集上清液，加入0.1倍體積的醋酸鈉(3 mol/L)，顛倒混勻，加入1倍體積的冰異戊醇，輕柔混勻后靜置20 min。12 000 g離心5 min，棄去上清液，加500 μL 70%的乙醇洗滌沉淀。棄去上清液，沉淀自然風(fēng)干。沉淀加50 μL Tris-EDTA緩沖溶液回溶，冷藏備用。

1.4.2 基因組DNA擴(kuò)增及焦磷酸測(cè)序

DNA擴(kuò)增采用的是細(xì)菌16s rDNA V1-V3區(qū)通用引物。具體的PCR擴(kuò)增引物:

正向引物為27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;

反向引物為533R:5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’。

反應(yīng)體系見表3:

表3 PCR反應(yīng)體系(20 μL)Table 3 PCR reaction system(20μL)

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后用于測(cè)序，焦磷酸測(cè)序按照454 Roche GS-FLX的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。454焦磷酸測(cè)序結(jié)果已上傳到MG-RAST網(wǎng)站，Ru12和Ru13樣品編號(hào)分別為4552295.3和4552296.3。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行篩選:

(1)長(zhǎng)度篩選(篩選出原始序列中長(zhǎng)度大于300 bp的序列)。

(2)引物匹配(blastn 的方法，W=4，e=0.1，找到序列上與引物匹配的片段，確定上下游引物的位置)。

(3)可變區(qū)篩選(找到引物位置后，認(rèn)為兩端引物之間的片段為可變區(qū)，選出其中長(zhǎng)度大于300 bp的片段)。

(4)tag匹配(tag按照樣本-tag編號(hào)篩選，不允許錯(cuò)配，且必須為首7位)。

(5)質(zhì)量控制(整條序列上質(zhì)量大于20的堿基所占比例須高于93%)。

經(jīng)過以上5步篩選，認(rèn)為提取出的序列是長(zhǎng)度、質(zhì)量、引物、tag均有效的高質(zhì)量序列。通過序列的聚類以給定相似度0.97水平上劃分操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)，選取每一 OTU 的代表性序列進(jìn)行注釋。使用本地BLAST的方法比對(duì)，采用Ribosomal Database數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的鑒定

采集自俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)埃利斯塔市郊的2份發(fā)酵蔬菜樣品共分離鑒定出19株乳酸菌，分屬于植物乳桿菌屬(14株)、片球菌屬(3株)和明串珠菌屬(2株)，其中Ru12樣品分離鑒定出11株，Ru13樣品為8株。對(duì)這些分離株進(jìn)行16S rDNA序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參見圖1。通過BLAST序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知:所有19株菌初步歸于三大群，其中有7株菌與Lactobacillus plantarum(T)AJ965482同源性在99%以上，將其歸屬為L(zhǎng)actobacillus plantarum;有1株菌與 Lactobacillus brevis ATCC 367同源性為100%，將其歸屬為L(zhǎng)actobacillus brevis;有2株菌與Lactobacillus delbrueckii(T)ATCC 11842同源性在99%以上，將這2株菌歸屬為L(zhǎng)actobacillus delbrueckii;有1株菌與 Lactobacillus helveticus(T)AM113779同源性在99%以上，將其歸為L(zhǎng)actobacillus helveticus;有 1株菌與 Lactobacillus kefiranofaciens AM113782同源性在99%以上，將其歸屬為L(zhǎng)actobacillus kefiranofaciens;有 2株菌與 Lactobacillus kefiri(T)AJ621553同源性在99%以上，將這2株菌歸屬為L(zhǎng)actobacillus kefiri;有1株菌與Leuconostoc lactis(T)AB023968同源性在99%以上，將其歸屬為L(zhǎng)euconostoc lactis;有1株菌與 Leuconostoc mesenteroides(T)ATCC 8293同源性為100%，將其歸屬為L(zhǎng)euconostoc mesenteroides;有2株菌與Pediococcus ethanolidurans AY956789同源性大于99%，將這2株菌歸屬為Pediococcus ethanolidurans;有1株菌與Pediococcus pentosaceus ATCC 25745同源性大于99%，將其歸屬為Pediococcus pentosaceus。對(duì)于上述分離菌株的生物學(xué)特性還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析和驗(yàn)證，從而進(jìn)一步篩選適合發(fā)酵蔬菜工業(yè)化生產(chǎn)的菌株。

圖1 19株待測(cè)菌株與參考菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 16S rDNA of reference strains and nineteen isolates

2.2 樣品中細(xì)菌豐度和多樣性分析

通過454焦磷酸測(cè)序，Ru12發(fā)酵蔬菜共得到10 869條高質(zhì)量序列，Ru13樣品為12 204條，經(jīng)過PyNAST alignment和100%序列鑒定聚類(sequence identity clustering)分析后，共得到2 664條代表性序列。繼而在97%相似度水平上劃分OTU，Ru12和Ru13樣品分別發(fā)現(xiàn)148個(gè)和123個(gè)細(xì)菌OTU。

由圖2可知，2份發(fā)酵蔬菜的稀疏曲線均未進(jìn)入平臺(tái)期，這表明隨著測(cè)序量的增加新的種系型有可能被發(fā)現(xiàn)，但同時(shí)Shannon曲線已經(jīng)飽和，表明隨著測(cè)序量的增加細(xì)菌的多樣性已經(jīng)不再隨之發(fā)生變化。

對(duì)于一個(gè)試驗(yàn)中至少需要多少條高質(zhì)量的16S rRNA序列才能滿足后續(xù)的科研分析一直是科研人員比較關(guān)心的問題。既往研究表明，如果只是在門的水平上分析樣品中微生物組成，那么幾百條高質(zhì)量的454焦磷酸測(cè)序序列就足夠了，而如果要檢測(cè)樣品中多數(shù)優(yōu)勢(shì)微生物的菌群結(jié)構(gòu)，幾千條序列足以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?9］。本實(shí)驗(yàn)中2個(gè)樣品測(cè)序量都已到達(dá)一萬以上，結(jié)合以往的經(jīng)驗(yàn)，在該測(cè)序水平上測(cè)序結(jié)果已能夠充分揭示2份樣品中細(xì)菌的組成。

通過chao1指數(shù)對(duì)樣品的豐度進(jìn)行比較，Ru12和Ru13兩份樣品的chao1指數(shù)分別為233.8和171.0，表明Ru12樣品中細(xì)菌的豐度比Ru13樣品要高。通過simpson指數(shù)對(duì)樣品的多樣性進(jìn)行比較分析，Ru12和Ru13兩份樣品的simpson指數(shù)分別為0.527和0.534，這表明2份樣品中細(xì)菌的多樣性差別不大。

圖2 兩份發(fā)酵蔬菜樣品的稀疏曲線和Shannon曲線Fig.2 Rarefaction analysis and shannon diversity index of two fermented vegetable simples

2.3 樣品中細(xì)菌相對(duì)含量的比較分析

通過在97%相似度上劃分OTU，每一OTU選取出現(xiàn)次數(shù)最多的序列為代表性序列，采用本地BLAST的方法進(jìn)行注釋，在門的水平上，兩份樣品都主要由硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成，在Ru12樣品中，上述門類細(xì)菌的含量分別為96.26%、3.66%、0.04%、0.02%，在Ru13樣品中，其含量分別為 97.64%、2.27%、0.07%、0.02%，參見圖3、圖4。

圖3 兩份發(fā)酵蔬菜樣品中細(xì)菌的組成Fig.3 Compositions of bacteria in two fermented vegetable samples

由圖3、圖4可知，在屬的水平上，2份樣品中含量最高的細(xì)菌屬主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、弧菌屬(Vibrio)、片球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、克魯維菌屬(Kluyvera)等。在Ru12樣品中這些菌屬的相對(duì)含量依次為 89.41%、3.95%、3.14%、1.61%、0.64%、0.08%，在Ru13樣品中的相對(duì)含量依次為93.65%、3.69%、1.69%、0.7%、0.08%、0.21%。由此可見，在2份樣品中，占據(jù)支配地位的菌屬都是乳桿菌屬(Lactobacillus)，其次為乳球菌屬(Lactococcus)和弧菌屬(Vibrio)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與乳酸菌分離鑒定中分離到的乳桿菌屬的數(shù)量占到絕大多數(shù)的結(jié)果相吻合。通過上述結(jié)果我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有意思的現(xiàn)象，在2份樣品中弧菌屬(Vibrio)都占據(jù)了其中相當(dāng)大的比例，而該菌屬的很多種類是具有致病性的，對(duì)于樣品中弧菌屬的來源我們還需進(jìn)一步研究。

Ji［20］等采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)韓國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜Kimchi中的微生物組成進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Kimchi中最主要的細(xì)菌屬依次為明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)，而明串珠菌屬(Leuconostoc)和魏斯氏菌屬(Weissella)在本文所研究的樣品中相對(duì)含量都很低。這說明不同地區(qū)、不同發(fā)酵蔬菜種類中微生物的構(gòu)成存在很大差異，可能正是這些微生物構(gòu)成的差異造就了不同發(fā)酵蔬菜所特有的口感和風(fēng)味。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)采集自俄羅斯卡爾梅克共和國(guó)埃利斯塔市郊的2份發(fā)酵蔬菜采用純培養(yǎng)結(jié)合16S rRNA序列比對(duì)分析的方法，共從2份樣品中分離出19株乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定和分型，鑒定結(jié)果為7株Lactobacillus plantarum;1株Lactobacillus brevis;2株Lactobacillus delbrueckii;1株Lactobacillus helveticus;1株Lactobacillus kefiranofaciens;2株Lactobacillus kefiri;1株Leuconostoc lactis;1株Leuconostoc mesenteroides;2株P(guān)ediococcus ethanolidurans;1株P(guān)ediococcus pentosaceus。同時(shí)運(yùn)用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，本研究從宏基因組水平分析了2份發(fā)酵蔬菜樣品中細(xì)菌的豐度和多樣性，發(fā)現(xiàn)隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)是2份樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬，這也證實(shí)了之前通過純培養(yǎng)方法得到的部分研究結(jié)論。此外，通過454焦磷酸測(cè)序技術(shù)我們對(duì)發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌的豐度和多樣性有了一個(gè)更加全面深入的認(rèn)識(shí)。例如，我們?cè)谘芯恐羞€發(fā)現(xiàn)了樣品中部分有害菌屬的存在，這是之前研究未曾報(bào)道的現(xiàn)象。上述研究成果對(duì)于發(fā)酵蔬菜工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展具有積極的促進(jìn)作用。

圖4 兩份發(fā)酵蔬菜樣品中細(xì)菌相對(duì)含量的比較Fig.4 Relative abundance of bacteria in two fermented vegetable samples

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