王 芳，俸軍林 ，張小芬，蔣靜子，吳 嵐，梁 靜，陳春蓮，易玉芳

1)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 桂林541001 2)桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年科 桂林541001

#通訊作者，男，1965年6月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向:癲癇與腦血管病，E－mail:2274196104@qq.com

癲癇是由各種原因引起的腦細(xì)胞異常放電導(dǎo)致的腦功能障礙綜合征，雖然80%左右患者的癲癇發(fā)作能被現(xiàn)代抗癲癇藥控制，但仍有約20%的患者反復(fù)發(fā)作，且大部分患者需長期甚至終生服藥治療，尋找更安全、高效的療法和方藥具有很重要的臨床意義。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，GBE)是從銀杏葉中利用醇溶液提取出的混合成分，它除了對(duì)心血管系統(tǒng)具有明顯的藥理作用外，對(duì)減少神經(jīng)細(xì)胞損傷、增加神經(jīng)遞質(zhì)的含量、改善腦細(xì)胞功能、促進(jìn)腦功能恢復(fù)等也具有很好的藥理作用，可作為抗癲癇的輔助藥物［1］。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，研究［2］顯示其具有抑制局部和全身性癲癇發(fā)作的作用。該研究通過于側(cè)腦室注射紅藻氨酸(kainic acid，KA)建立癲癇模型，觀察不同劑量GBE 急性期給藥對(duì)癲癇的干預(yù)效應(yīng)及其對(duì)NPY 蛋白表達(dá)的影響，以探討GBE 的抗癲癇機(jī)制，為開發(fā)出高效、廣譜、低毒的抗癲癇藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 KA 注射液購自美國Sigma公司，銀杏葉提取物761(GBE761)購自西安天本生物工程有限公司，兔抗大鼠NPY 蛋白多克隆抗體購自Bioworld Technology 公司，日本產(chǎn)Narishige SR－6R型大鼠腦立體定向儀、電子顯微鏡等。

1.2 動(dòng)物分組及給藥方法 雄性SD 大鼠90 只，體重250～300 g，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在溫暖(20℃)、避強(qiáng)光、避噪音、自由進(jìn)食及飲水條件下單籠飼養(yǎng)。大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為以下幾組:假手術(shù)組(n=18);GBE 對(duì)照組(n =18)，用同體積的體積分?jǐn)?shù)50% 1，2－丙二醇代替GBE;癲癇模型組(n =18);小劑量GBE組(n =18)，于制備癲癇模型0.5 h 后按100 mg/kg 腹腔注射溶于體積分?jǐn)?shù)50%的1，2－丙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的GBE761 注射液;大劑量GBE組(n=18)，于制備癲癇模型后0.5 h 按200 mg/kg 腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的GBE761 注射液。根據(jù)致癇后處死時(shí)間不同，各組再分為造模成功后6、12 及24 h 3 個(gè)亞組(n=6)。

1.3 癲癇模型制作 采用腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(0.036 mL/kg)麻醉，將大鼠頭部固定于立體定向儀上，剪除其頭部的毛發(fā)，局部消毒;術(shù)者戴無菌手套，沿頭部正中線切開頭皮10～15 mm，接著用體積分?jǐn)?shù)30%的雙氧水腐蝕顱骨上腱膜及顱骨外膜，暴露前囟。依照大鼠腦立體定向圖譜定位右側(cè)側(cè)腦室，鉆一直徑為1.0 mm 的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面。將預(yù)先裝有KA 的微量進(jìn)樣器沿鉆孔進(jìn)針，進(jìn)針深度達(dá)4.5 mm 時(shí)向側(cè)腦室內(nèi)注射0.8 g/L KA 溶液1 μL，在10 min 內(nèi)緩慢勻速地注射完畢，留針5 min 后緩慢拔針。最后用骨蠟封閉顱骨所鉆孔，縫合頭皮，放回籠中進(jìn)行行為學(xué)觀察。假手術(shù)組不注射KA。

1.4 大鼠行為學(xué)觀察 將大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別分為6 級(jí)。0 級(jí):正常;Ⅰ級(jí):立須、咀嚼等面肌抽動(dòng);Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭等頸肌抽動(dòng);Ⅲ級(jí):一側(cè)前肢的抽動(dòng)、陣攣;Ⅳ級(jí):雙側(cè)前肢的抽動(dòng)、陣攣，伴站立;Ⅴ級(jí):四肢強(qiáng)直、抽動(dòng)，伴站立、跌倒及身體強(qiáng)直背曲。觀察各組大鼠的行為2 h 并記錄癲癇發(fā)作級(jí)別，Ⅲ級(jí)及以下為輕型發(fā)作，Ⅳ～V 級(jí)為重型發(fā)作。Ⅳ～V 級(jí)視為癲癇造模成功，如果造模失敗，則以相同數(shù)量動(dòng)物補(bǔ)充造模。

1.5 灌注取材及標(biāo)本制備 先將大鼠麻醉，再剪開大鼠胸腔暴露心臟，將針頭從大鼠心尖刺入，同時(shí)剪開右心耳放血。接著向心臟內(nèi)快速推注生理鹽水約200 mL，使從右心耳流出的液體最終清亮，肺臟變白。然后向心臟內(nèi)快速灌注40 g/L 多聚甲醛約400 mL，使四肢及頭尾變硬。注射完畢即刻斷頭取腦，于40 g/L 多聚甲醛中固定24 h。取前囟后2.5～4.5 mm 處腦組織，脫水包埋制成蠟塊，用于HE 染色及免疫組化染色。

1.6 海馬組織HE 染色 切取石蠟切片，厚約3 μm，進(jìn)行HE 染色，置于顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.7 海馬組織NPY 蛋白免疫組化染色 切取石蠟切片，厚約4 μm，進(jìn)行免疫組化染色，取海馬齒狀回門區(qū)組織觀察NPY 蛋白，陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。光學(xué)顯微鏡下觀察5 個(gè)高倍(×400)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取其均值作為NPY 蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。5組間以及3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)間海馬組織NPY 蛋白表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察結(jié)果 見表1。假手術(shù)組無癇樣發(fā)作，GBE 對(duì)照組和癲癇模型組均為Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，小劑量GBE組與大劑量GBE組均為Ⅱ～Ⅳ級(jí)發(fā)作。

表1 各組大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果例

2.2 海馬組織HE 染色結(jié)果 在KA 注射后6 h 即可見癲癇模型組注射側(cè)海馬各區(qū)神經(jīng)元受到損害，正常細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死，尤以海馬CA3 區(qū)最明顯。變性的神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，細(xì)胞排列不整齊、輪廓不清、間隙增大，核仁模糊，胞核移位。壞死的神經(jīng)元胞質(zhì)濃縮、深染，核碎裂;星形膠質(zhì)細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)淡染;齒狀回顆粒細(xì)胞部分受損，細(xì)胞排列雜亂，胞核固縮。于KA 注射后12 h 神經(jīng)元變性、壞死更明顯。KA 注射后24 h，CA3 區(qū)錐體細(xì)胞脫失，細(xì)胞排列稀疏、層次減少;小劑量GBE組與大劑量GBE組CA3 區(qū)神經(jīng)元損害均較癲癇模型組減輕;GBE 對(duì)照組CA3 區(qū)神經(jīng)元損害程度與癲癇模型組相同。見圖1。

圖1 各組大鼠KA 注射后24 h 右側(cè)海馬CA3 區(qū)HE 染色(1)和齒狀回區(qū)NPY 蛋白免疫組化染色(2)結(jié)果(×400)

2.3 海馬組織免疫組化染色結(jié)果 見圖1、表2。

表2 各組大鼠右側(cè)海馬齒狀回區(qū)NPY 蛋白表達(dá)量比較

3 討論

GBE 所含成分銀杏總黃酮苷和銀杏苦內(nèi)酯等具有擴(kuò)張腦血管、促進(jìn)腦血液循環(huán)、增加腦血流量等作用，可改善缺氧腦細(xì)胞的能量代謝和營養(yǎng)，提高腦細(xì)胞耐缺氧能力，減輕腦水腫，減少神經(jīng)細(xì)胞損傷，增加神經(jīng)遞質(zhì)的含量，改善腦細(xì)胞功能，促進(jìn)腦細(xì)胞的恢復(fù)［1－3］。該實(shí)驗(yàn)中KA 模型有與人類顳葉癲癇極為相似的海馬硬化神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)改變及癲癇發(fā)作行為特征［4－5］，結(jié)果顯示，GBE 對(duì)照組和癲癇模型組均為Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，小劑量及大劑量GBE組均為Ⅱ～Ⅳ級(jí)發(fā)作。結(jié)果表明GBE 對(duì)致癇大鼠具有一定抗癲癇作用，GBE 急性期給藥能減少致癇大鼠神經(jīng)元損害并減輕其癲癇發(fā)作程度，但2 種劑量GBE的效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

NPY 是一種含36 個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽，大腦皮層、海馬、丘腦及下丘腦為其主要分布區(qū)。NPY 具有多方面的生物學(xué)作用［6］。另外，在神經(jīng)元興奮性尤其是在中間神經(jīng)元的釋放方面，NPY 也發(fā)揮著極其重要的作用［7］。此外，還有研究［8］顯示，癲癇的短暫發(fā)作誘導(dǎo)的NPY 持續(xù)過度表達(dá)在預(yù)防癲癇方面有重要作用。海馬旁區(qū)域的可塑性及NPY 過度表達(dá)可被癲癇的反復(fù)發(fā)作持久激活［9］。癲癇發(fā)作后腦組織內(nèi)NPY 表達(dá)增多是機(jī)體抑制癲癇發(fā)作的代償機(jī)制，同時(shí)也是機(jī)體自我保護(hù)機(jī)制的表現(xiàn)［10－12］。該實(shí)驗(yàn)中，同一處死時(shí)間點(diǎn)各組大鼠相比較，癲癇模型組海馬中NPY 蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增多，同組內(nèi)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)NPY 蛋白表達(dá)量呈上升趨勢，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述理論。該實(shí)驗(yàn)中，小劑量GBE組和大劑量GBE組NPY 蛋白的表達(dá)量均高于癲癇模型組，由此推測GBE 的抗癲癇作用很可能是通過上調(diào)NPY 的表達(dá)進(jìn)一步激發(fā)NPY 的抑制癲癇作用來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，2 種劑量GBE 急性期給藥均可使大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別降低，神經(jīng)元損害減輕，NPY 蛋白表達(dá)增多，提示GBE 急性期給藥有一定的抗癲癇作用。GBE 的抗癲癇機(jī)制與減輕神經(jīng)元的損害、降低癲癇發(fā)作程度、上調(diào)NPY 蛋白的表達(dá)有關(guān)，這種作用機(jī)制有可能是抗癲癇治療的一種新思路。

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