許 麗，梁 文，李 妍，任淑貞，丁 敏，劉 剛

（上海市計量測試技術研究院，上海 201203）

0 引 言

質粒分子標準物質是一種含有外源目的基因片段的重組分子[1]，具有制備成本低，易于富集，穩(wěn)定性好的優(yōu)點。由于微生物檢測領域部分陽性樣品難以獲得，帶有特異性目標檢測基因的質粒分子標準物質，成為解決病原微生物分子生物學檢測量值溯源問題的途徑之一，廣泛應用于各種PCR檢測領域[2]。本文研制的阪崎腸桿菌檢測質粒DNA標準物質在PCR定性定量檢測中可以作為陽性對照或者定量標準，解決了相關分子生物學檢測實驗室陽性樣品缺乏的難題。本文主要報道了該標準物質在定值過程中的數據統(tǒng)計和不確定評定過程。

根據JJF 1343——2012《標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》[3]的要求，我們選擇第三類定值方案：使用一種或多種已經證明準確性的方法，由多個實驗室合作定值。具體的定值方法分為兩種：

1）紫外分光光度法（UV）。核酸分子含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，其紫外可見吸收光譜在260nm附近有一強的吸收峰。針對雙鏈DNA，樣品濃度和吸光值之間有以下關系：雙鏈DNA樣品濃度（ng/μL）=OD260×核酸稀釋倍數×50，其中 OD260為核酸在260nm處的吸光值[4]。

2）高分辨電感耦合等離子體質譜（HR-ICP-MS）。由于DNA分子結構可知，對于序列已知的DNA分子，DNA分子中磷元素的含量和DNA分子的數量有固定線性關系。在DNA中，每個堿基對應一個磷原子，分子中磷元素含量（質量分數）可由下式計算：磷元素含量（P%）=堿基數×磷的原子量÷DNA分子量。因此可以通過測定DNA樣品中的磷元素的含量換算出DNA的濃度，DNA濃度可由下式計算：DNA濃度=實驗測定的磷元素含量÷DNA分子含磷量（P%）[5]。

在質粒DNA標準物質的研制過程中，一共有9家實驗室參與了合作定值，本文報道了數據統(tǒng)計過程，并對實驗結果的影響因素進行了分析，對測量結果的不確定度進行了評定。

1 實驗部分

1.1 主要定值檢測儀器與試劑

微量核酸蛋白定量儀（nanodrop ND-2000）；紫外分光光度計（Lambda950）；電感耦合等離子體發(fā)射質譜儀（Thermo Fisher Element2）。

重鉻酸鉀溶液標準物質（GBW（E）081609，標準值0.099 9 mol/L，相對不確定度為0.2%）；磷標準溶液（NIST，SRM3139a，10.016±0.033mg/L）等。

1.2 定值過程

一共有8家實驗室使用UV法對質粒DNA標準物質進行定值，其中有1家實驗室采用HR-ICPMS法。每家實驗室分別對質粒DNA標準物質，平行測定8次，進行定值分析。

1.2.1 UV測定質粒DNA標準物質

實驗步驟：1）用TE緩沖液作為空白溶液，使紫外分光光度計校正為零點；2）取適量DNA（根據儀器的需要）進行檢測，記錄儀器讀數，濃度單位為ng/μL；3）每個樣品檢測8次，記錄實驗結果。

1.2.2 HR-ICP-MS測定質粒DNA標準物質

在采用元素分析法對DNA定量之前，首先要確定質粒DNA具有足夠的純度，繼而需要根據質粒DNA標準物質的堿基組成和序列長度，計算其中磷元素的含量，這樣就能估算適合的稀釋倍數。在本實驗中，我們最終將實驗室研制的質粒DNA標準物質稀釋2000倍，從而落在HR-ICP-MS最優(yōu)的P元素檢測范圍[6-7]。 以磷標準溶液（NIST，SRM3139a）制備1～5 ng/mL范圍標準曲線，對質粒DNA標準物質進行定量檢測。經過一系列的研究和優(yōu)化，最終確定HR-ICP-MS主要技術參數：冷卻氣流量16.86L/min，霧化氣流量為1.123L/min，輔助氣流量為0.99L/min，功率1350W。每個樣品檢測8次，并記錄實驗結果。

1.3 定值數據統(tǒng)計

在得到測定結果后，根據統(tǒng)計方法要求[3，8]對測定結果進行統(tǒng)計處理。通過統(tǒng)計學評估的數據如表1所示。

表1 質粒DNA標準物質pXL06定值結果1）

2 不確定度的評定

質粒DNA標準物質的定值過程帶來的不確定度uchar包括數據統(tǒng)計引入的不確定度uchar1和通過對定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度uchar2。

2.1 數據統(tǒng)計引入的不確定度uchar1

質粒DNA標準物質由數據統(tǒng)計引入的不確定度即是使用兩種方法，由9家實驗室合作定值數據統(tǒng)計引入的不確定度。由于確認的特性值恰好是各組平均值的平均值（即各組數據不存在平均值和標準偏差的不一致性），即如下式所示：

式中：——總平均值；

Yi——各組數據的平均值；

p——實驗室數目。

那么，與平均值的平均值相關的合成標準不確定度的基礎是標準偏差，可由下式獲得：

合成標準不確定度為

相對不確定度為

2.2 定值方法中測量影響因素進行分析評定的不確定度uchar2

2.2.1 UV方法測量影響因素引入的不確定度

用UV對質粒標準物質進行定值，檢測時儀器利用液體的表面張力特性控制樣品池中的樣品量，因此測量影響因素引入的不確定度即為儀器本身引入的不確定度。

本文用重鉻酸鉀溶液標準物質（GBW（E）081609）考察了紫外分光光度計在257 nm處吸光值的準確性，其中相對標準偏差為0.02%，即該相對不確定度為 0.02%（見表 2）。

表2 吸光值準確性考察

2.2.2 HR-ICP-MS方法測量影響因素引入的不確定度

1）數學模型的建立

充分考慮樣品檢測過程中的各種影響因素，建立不確定評估模型如下：

式中：c——質粒DNA標準物質濃度；

cs——由標準曲線求得樣品液中P含量；

Vs——檢測時樣品最終體積；

V——吸取質粒DNA標準物質原液體積；

9.6%——質粒DNA分子中P元素含量（由堿基數×磷的原子量÷DNA分子量計算得出）。

其中質粒DNA標準物質濃度標準不確定度用uc（c）表示，由標準曲線計算的樣品液中P含量標準不確定度用uc（cs）表示，樣品溶液制備體積不確定度用uc（Vs）表示，吸取質粒標準物質原液時引入的不確定度用uc（V）表示。由此得到的相對標準不確定度傳播率為

2）cs不確定度的計算

cs的不確定度由兩部分組成：當由5種P標準溶液的質量濃度（1，2，3，4，5 ng/mL）與 P 標準物質產生的信號強度擬合的直線求得cs時測量所產生的不確定度；由標準貯備液配制成5種質量濃度標準溶液時所產生的對cs測量所產生的不確定度。

①由擬合曲線求得cs時所產生的不確定度uc，1（cs）

用HR-ICP-MS測定質粒標準物質中的P含量，利用 P標準物質（NIST，SRM3139a）配制 5種標準 溶 液 ，P 質 量 濃 度 分 別 為 1，2，3，4，5 ng/mL，用HR-ICP-MS對上述5種P標準溶液進行測定，結果見表3。

表3 各質量濃度下P標準物質質譜信號豐度測量值

根據測定結果建立標準曲線，經過線性擬合得出：

式中：A——質譜信號豐度；

cm——溶液中P元素的含量。

對cs進行8次測量，通過曲線方程求得cs=3.57ng/mL，則cs的標準不確定度[9-10]為

式中B1=3514.8；

P=8（對cs進行 8 次測量），n=5（共 5 次測量）；

將上述各值代入式（8）得到：

②配制P標準工作溶液的不確定度uc（c5）

以5ng/mL標準工作溶液為例闡述不確定度的大小，其配制步驟為：用最大量程為1 mL的移液器移取 1mL P 標準溶液（10.016±0.33）mg/L，定容至10 mL，配成1 mg/L的標準溶液，稀釋因子為f1=10；用上述1mL的移液器移取1mg/L P標準溶液1mL，定容至10mL，配成0.1mg/L的標準溶液，稀釋因子為f2=10；用上述1mL的移液器移取0.1mg/L P標準溶液1 mL，定容至10 mL，配成0.01 mg/L的標準溶液，稀釋因子f3=10；用最大量程為5mL移液器移取0.01mg/L的標準溶液5mL，定容至10mL，配成5ng/mL標準工作溶液，稀釋因子f4=2，則：

所以：

（B）1mL移液器移取1mL時引入的不確定度uc（V1）

（C）10mL 容量瓶引入的不確定度 uc（V10）

（D）最大量程為5 mL的移液器移取5 mL時引入的不確定度 uc（V5）

所以：

將上述值代入式（9），則：

則質粒DNA標準物質cs的相對不確定度合成為

3）樣品溶液制備體積 Vs的不確定度 uc（Vs）

樣品溶液制備過程如下：取5μL質粒標準物質原液，定容至10mL，則稀釋倍數為2000倍。

①由10 μL移液器移取5 μL時產生的不確定度 uc（V0.005）

（B）移液器和溶液的溫度與校正時溫度不同引起的不確定度 uc，2（V1）：實驗室溫度控制在（20±3）℃（置信水平為95%），水的體積膨脹系數為2.1×10-4/℃，因此產生的體積變化為±3×5×2.1×10-4=±0.0032μL，按照均勻分布轉化：

則：

②10mL容量瓶引入的不確定度uc（V10）

所以，樣品溶液體積Vs引入的相對不確定度合成為

4）吸取質粒標準物質原液時引入的不確定度uc（V）

吸取質粒標準物質原液時引入的不確定度：

因此將式（10）、式（11）、式（12）代入式（6），得到HR-ICP-MS檢測質粒DNA標準物質的相對標準不確定度為：

2.2.3 兩種方法測量過程影響因素引入的合成相對不確定度

將紫外方法和HR-ICP-MS方法測量過程影響因素引入的相對不確定度進行合成：

2.3 質粒DNA標準物質的定值過程引入的不確定度uchar總結

最終，將定值過程引入的相對不確定度合成：

合成不確定度 uchar=75.1×1.4%=1.05ng/μL。 取包含因子 k=2，則擴展不確定度 U=2×1.05=2.1 ng/μL，相對擴展不確定度為2.8%（k=2）。因此，測得的質粒DNA 標準物質的濃度表示為：（75.1±2.1）ng/μL（k=2）。

表4 各相對不確定度分量計算結果

3 結束語

本文應用UV和HR-ICP-MS兩種方法，對質粒DNA標準物質進行定值，為了得到更準確的實驗結果，并且結果可以溯源至國際單位。本文以一種質粒DNA為例，綜合考慮了實驗過程中影響結果的各種因素，探討了此類定值方法過程中的不確定來源，最終對不確定度的評定方法和步驟進行了分析。

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