文│張晶 陳奎春 溫富勇 趙海明 張利娟（北京市密云縣農(nóng)業(yè)局 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市奶牛創(chuàng)新團隊）

目前北京市密云縣大多數(shù)奶牛養(yǎng)殖場對奶牛妊娠診斷還采用傳統(tǒng)的配種后60天進行直腸觸診法，既浪費人力物力，又增加牛與人之間疾病的傳播。2014年4月密云縣引進了先進的奶牛早期妊娠診斷技術(shù)，使用“28天可視孕檢試劑盒”，對配種后28天的奶牛采血樣分離血清進行診斷，該技術(shù)將奶牛妊娠診斷時間提前了30天，一頭奶?？晒?jié)省30天的飼養(yǎng)成本，增加奶產(chǎn)量，節(jié)約飼料成本，降低了產(chǎn)犢間隔，改善繁殖狀況，并減少對妊檢人員身體的傷害，避免了人畜傳染病的發(fā)生。目前，該項技術(shù)已在密云縣7個奶牛養(yǎng)殖場進行應(yīng)用，特異性達到了96%以上。本文簡述了通過對懷孕奶牛早期產(chǎn)生相關(guān)糖蛋白的檢測，來判定奶牛是否妊娠的早期診斷方法的操作及對養(yǎng)牛業(yè)應(yīng)用的意義。

表1 早期妊娠診斷技術(shù)的準(zhǔn)確性實驗

一、奶牛早期妊娠診技術(shù)的意義和原理

1.奶牛早期妊診斷的意義。目前，密云縣共有奶牛場31家，共有7家使用此項技術(shù)，2013年以前密云地區(qū)大多數(shù)牛場使用的妊娠診斷方法都是直腸觸診法，既浪費人力物力，又增加牛與人之間疾病的傳播。

對牛精準(zhǔn)及時的懷孕檢測在當(dāng)今的牧場繁殖管理程序中是一項十分重要的內(nèi)容。獸醫(yī)和牧場工作人員對牛進行早期懷孕檢測，查找出空懷牛，這樣可以盡快重配空懷牛以及縮短產(chǎn)犢間隔，從而為奶牛場帶來最高的牛奶產(chǎn)量和收益。

傳統(tǒng)上，通過對牛進行直腸觸診或超聲來診斷牛是否懷孕，一般45～60天以后才能監(jiān)測出結(jié)果。早期妊娠診斷技術(shù)，可以早在配種后28天就檢測到牛是否懷孕，特異性在96%～99%，該診斷方法為獸醫(yī)和奶牛場的工作人員提供了檢測懷孕牛的重要工具，給養(yǎng)殖戶帶來很大的經(jīng)濟效益。以1000頭規(guī)模的奶牛場為例，泌乳牛繁殖率可從75%提高到80%，產(chǎn)間距可以從16個月下降到15個月，空懷天數(shù)可以下降30天，即1000頭×30天×30元/天＝900000元，將牛群空懷天數(shù)下降30天，可以為牧場帶來90萬元的效益。

表2 久興奶牛場試驗應(yīng)用情況

2.早期可視孕檢的原理。早期可視孕檢試劑盒是根據(jù)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理設(shè)計的，用于檢測懷孕早期存在于牛血清的懷孕相關(guān)蛋白（PAGs），這類蛋白可以作為牛懷孕的標(biāo)志。微孔板已經(jīng)包被PAG抗體，將待檢樣品在包被板上進行稀釋并孵育后，捕獲到的懷孕相關(guān)蛋白（PAGs）可以與特異性的PAG抗體（檢測溶液）和辣根過氧化物酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗體）結(jié)合。未被結(jié)合的酶標(biāo)抗體則被洗掉，隨后在孔內(nèi)加入TMB底物溶液。孔內(nèi)溶液的顏色深淺與樣品中PAG的含量成比例。

二、此項技術(shù)在密云地區(qū)奶牛場的應(yīng)用

1.技術(shù)操作過程及要求。

（1）采取配種后28天以上奶牛的血樣。對配種28天以上奶牛的血樣進行分離血清，已備檢測。

（2）試驗操作程序。

第一步，試劑準(zhǔn)備。

在使用之前，所有的試劑盒組分都必須恢復(fù)到18～26℃。試劑應(yīng)通過輕輕渦旋、旋轉(zhuǎn)混合均勻。每個樣本都使用不同的吸頭。濃縮洗滌液要使用蒸餾水或去離子水進行10倍稀釋。

第二步，在酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）板中加入樣品及試劑。

在所有樣品和對照孔內(nèi)滴加一滴樣品稀釋液。使用試劑盒內(nèi)提供的移液器和附帶的吸頭，吸取陰性對照并分別加入兩個孔內(nèi)。吸取陽性對照并分別加入兩個孔內(nèi)。吸取樣品（血清）并加入適當(dāng)孔內(nèi)。不同樣品需更換吸頭。輕彈微量反應(yīng)板將反應(yīng)板中的溶液混勻，蓋好蓋板，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板：移除蓋板，快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，將板孔內(nèi)液體棄入廢液缸或水槽。用裝有洗滌溶液的洗瓶洗板3～5次。每次洗滌后快速翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板，棄去洗滌溶液。在最后一次洗滌完后，將反應(yīng)板在吸水紙上拍干。

第三步，加入檢測溶液。

在每個反應(yīng)孔中加入2滴檢測溶液。蓋好板蓋，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板。

第四步，加入酶標(biāo)抗體。

在每個反應(yīng)孔中加入2滴酶標(biāo)抗體。蓋好板蓋，在18～26℃條件下孵育30分鐘（可以有誤差2分鐘）。洗板。

第五步，加入底物液和終止液。

在每個反應(yīng)孔中加入2滴TMB底物溶液。在18～26℃條件下孵育15分鐘（可以有誤差1分鐘）。在每個反應(yīng)孔中加入2滴終止液終止反應(yīng)。在加終止液時要按加入底物溶液的順序進行滴加。輕彈微量反應(yīng)板將反應(yīng)板中的溶液混勻。肉眼進行讀板，對照孔呈藍色的為陽性。

第六步，讀板及結(jié)果判定。

動物的懷孕狀態(tài)是由肉眼觀察孔內(nèi)顏色決定的。如未觀察到藍色，顏色與陰性對照孔顏色相似，則此動物被認為是空懷。如觀察到藍色，則存在PAGs，此動物被認為是懷孕。如樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則認為可疑/疑似，推薦懷孕復(fù)檢。

2.應(yīng)用情況。

（1）為進一步驗證該試劑的準(zhǔn)確性，在一奶牛場采集奶牛血樣17頭份，其中包括直腸檢查已確定妊娠的奶牛，沒配種的空懷牛奶牛和配種后待檢奶牛。具體情況如表1。

經(jīng)檢測，其中2頭已懷孕奶牛檢測結(jié)果為陽性，2頭未配種的奶牛檢測結(jié)果為陰性，說明早期妊娠診斷試劑盒的準(zhǔn)確率為100%。

（2）應(yīng)用的效果分析。2014年5月21日對密云縣十里堡鎮(zhèn)久興奶牛場的24頭待檢奶牛進行檢測。具體情況如表2。

共檢測24頭奶牛，其中28～35天采血用早期妊娠診斷試劑盒檢測出18頭為陽性，6頭為陰性，60天直腸檢查18頭陽性牛中有3頭為陰性，陰性的原因有可能為早期胚胎死亡。

三、小結(jié)

在現(xiàn)代規(guī)?；翀龉芾碇?，提高奶牛終生產(chǎn)奶量，改變牧場繁殖效益是養(yǎng)殖戶追求的目標(biāo)。奶牛終身可以有更多的泌乳高峰，生產(chǎn)奶量的增加，較短的繁殖周期，可以提高繁殖性能和經(jīng)濟效益，這必須通過縮短配種期來實現(xiàn)，這些就需要盡早診斷出已配奶牛是否已經(jīng)懷孕。奶牛早期可視妊娠診技術(shù)具有操作簡便，準(zhǔn)確率高，增加奶產(chǎn)量，節(jié)約飼料成本等優(yōu)點，所以此項技術(shù)的應(yīng)用對于養(yǎng)牛業(yè)具有重要的意義。