遲曉星 張明玉 張 濤 鄭麗娜 張麗媛

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)，大慶 163319)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常見的內(nèi)分泌紊亂疾病之一［1］，影響了7%～10%的婦女。育齡期PCOS的臨床或生化表現(xiàn)包括不規(guī)則的月經(jīng)周期、多囊性卵巢和雄激素過多［2］。關(guān)于PCOS的病因、病理及治療藥物的作用途徑尚不明確，在這方面的研究中卵巢細胞凋亡信號的表達是其中的研究熱點之一?？沟蛲龌駼cl-2是許多生理或病理性細胞凋亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因素，它可以通過影響細胞內(nèi)信息傳導(dǎo)而影響凋亡，對多種因素引發(fā)的細胞凋亡有抑制或延緩作用［3］。Bax蛋白是與Bcl-2相關(guān)的同源性蛋白，可作為Bcl-2的拮抗劑。所以藥物如果能夠在正常限度內(nèi)增強Bcl-2 mRNA的表達，抑制促凋亡基因Bax mRNA的表達，對延緩或減少細胞凋亡具有重要意義。

植物雌激素是已知的可影響多囊卵巢動物排卵的物質(zhì)［4］。已有研究證明，膳食中植物雌激素可影響人類 PCOS［5］，該綜合征的特異性可通過PCOS動物模型反映出來。金雀異黃素(genistein，GEN)作為異黃酮類化合物屬于植物雌激素，是大豆異黃酮的主要成分［6］，存在于富含豆肽的多種天然植物中，其分子結(jié)構(gòu)與人體自身雌激素相同。GEN進入人體后，可完全與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素的作用。對于不同組織，還可產(chǎn)生與雌激素相拮抗的作用，具有雌激素表達雙向調(diào)節(jié)效應(yīng)。GEN在預(yù)防乳腺癌、結(jié)腸癌和心血管疾病方面的研究報道較多，用于預(yù)防PCOS的報道較少。因此，本研究通過建立PCOS動物模型，以GEN為受試物，采用原位雜交方法檢測大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax mRNA表達情況，從細胞凋亡角度探討植物雌激素GEN對PCOS大鼠卵巢的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

GEN:美國 Sigma公司，純度 ＞99.9%;己烯雌酚:合肥久聯(lián)制藥有限公司，每片0.5 mg;人體絨毛膜促性腺激素:四環(huán)藥業(yè)股份有限公司，每瓶5 000 IU;中效胰島素諾和靈:諾和諾德(巴西)進口藥品(H20091126);Bcl-2和Bax mRNA原位雜交檢測試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DRP-9082型:上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 試驗動物與分組

選擇雌性 Wistar大鼠90只，3月齡，體重(160±20)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗鼠類養(yǎng)殖中心提供(醫(yī)動字第20-006號，清潔級)。采取隨機分組方法分為6組，分別為對照組，模型組，GEN低、中、高劑量組及雌激素組，每組各15只。

1.3 PCOS試驗動物模型的建立與試驗設(shè)計

按照胰島素聯(lián)合人體絨毛膜促性腺激素造模法［7］建立PCOS試驗動物模型。所有大鼠給予充足的食物和濃度為5%的葡萄糖飲水，每天給予14 h的周期性光照。試驗的第1～10天給予模型組、劑量組和雌激素組大鼠逐漸增加劑量的中效胰島素諾和靈，由開始的0.5 IU/d逐漸增加至6.0 IU/d，試驗第 11～22天給予固定劑量6.0 IU/d，并加用人體絨毛膜促性腺激素6.0 IU/d，其中人體絨毛膜促性腺激素分2次注射，每次注射劑量為3.0 IU，對照組注射相同劑量的生理鹽水。造模后，連續(xù)陰道上皮細胞涂片2個性周期(每個周期5 d)，陰道角化細胞持續(xù)出現(xiàn)，提示造模成功。本試驗造模成功率為83%，每組各選出10只大鼠繼續(xù)后面的試驗。劑量組分別給予 5、10、20 mg/kg GEN，雌激素組給予0.5 mg/kg己烯雌酚，受試物灌胃給予，持續(xù)15 d，觀察動情周期10 d。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 大鼠卵巢組織中Bcl-2和Bax mRNA的表達

大鼠喂養(yǎng)7周后，麻醉，腹主動脈取血，大鼠死后，剖取大鼠卵巢和子宮，立即用4%體積分數(shù)的多聚甲醛/0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.6)的固定液固定，制作大鼠卵巢和子宮組織石蠟切片，厚度4μm，用70%體積分數(shù)的乙醇加1‰體積分數(shù)的焦碳酸二乙酯(DEPC)處理后，再用多聚賴氨酸處理，60℃恒溫箱烤片2 h。此后具體操作方法按Bcl-2和Bax mRNA原位雜交檢測試劑盒說明書操作。

卵巢顆粒細胞Bcl-2和Bax mRNA陽性評定標準:根據(jù)卵巢和子宮組織切片中顆粒細胞免疫組織化學(xué)染色的深淺分4級，未被染色的為陰性表達，深棕色為弱陽性表達，棕黃色為中度陽性表達，棕褐色為強陽性表達。為了統(tǒng)計方便，予以半定量計分:1、2、3、4分別對應(yīng)陰性表達、弱陽性表達、中度陽性表達、強陽性表達。每張切片至少觀察5個視野。主要觀察各組大鼠卵巢和子宮顆粒細胞Bcl-2和Bax mRNA陽性表達情況。

1.4.2 大鼠卵巢組織中抗氧化酶活性

測定試驗前后各組大鼠卵巢組織中超氧化物歧化酶(SOD)(羥胺法)、過氧化氫酶(CAT)(可見分光光度法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(比色法)活性和丙二醛(MDA)含量［硫代巴比妥酸(TBA)法］。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠卵巢組織中Bcl-2 mRNA的表達

Bcl-2 mRNA的陽性表達主要在大鼠卵巢組織的細胞胞漿中，由表1和圖1可知，各組大鼠卵巢組織中Bcl-2 mRNA陽性表達率不同，其中雌激素組大鼠卵巢組織細胞呈強陽性表達，棕褐色顆粒最多最明顯;高劑量組大鼠卵巢組織細胞棕黃色顆粒也比較明顯，陽性表達強，模型組與之相比陽性細胞少，顏色淺，棕黃色顆粒較少。這說明GEN可上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達量，與模型組相比，劑量在20 mg/kg的時候作用顯著(P＜0.05)。

2.2 大鼠卵巢組織中Bax mRNA的表達

Bax mRNA的陽性表達主要在大鼠卵巢組織的細胞胞漿中，呈棕黃色顆粒，由表2和圖2可知，模型組大鼠卵巢組織中陽性顆粒表達強，棕褐色顆粒多;雌激素組和高劑量組大鼠卵巢組織中棕黃色顆粒明顯減少，呈弱陽性表達，與模型組相比差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明GEN可不同程度地下調(diào)大鼠卵巢組織中Bax mRNA的表達量。

表1 大鼠卵巢組織中Bcl-2 mRNA的表達Table 1 The expression of Bcl-2 mRNA in rat ovarian tissue

圖1 大鼠卵巢組織中Bcl-2 mRNA的表達Fig.1 The expression of Bcl-2 mRNA in rat ovarian tissue

圖2 大鼠卵巢組織中Bax mRNA的表達Fig.2 The expression of Bax mRNA in rat ovarian tissue

2.3 大鼠卵巢組織中抗氧化酶活性變化

由表3可知，與試驗前相比，試驗后大鼠卵巢組織中SOD和CAT活性均升高，其中中、高劑量組顯著升高(P＜0.05);GSH-Px活性中劑量組顯著升高(P＜0.05);對照組和低劑量組MDA含量顯著升高(P＜0.05)，而中劑量組、高劑量組和雌激素組均顯著下降(P＜0.05)。

表3 大鼠卵巢組織中抗氧化酶活性變化Table 3 The change of antioxidant enzyme activity in rat ovarian tissue

3 討論

GEN是大豆中異黃酮的主要成分，主要以游離型苷元和結(jié)合型糖苷形式存在。GEN為多酚類化合物，相對分子質(zhì)量為270，其結(jié)構(gòu)和相對分子質(zhì)量與雌二醇類似，可介導(dǎo)弱的雌激素樣作用。其雌激素活性僅為雌二醇的0.001% ～0.100%，又被稱為植物雌激素。研究表明GEN具有抑制腫瘤、雌激素樣作用、影響骨代謝和心血管系統(tǒng)及抗氧化等廣泛藥理活性。目前對于GEN的雌激素樣作用的研究主要集中在乳腺癌、絕經(jīng)期綜合征的預(yù)防和治療方面，而對PCOS的研究報道較少。

動物卵巢是許多化學(xué)物質(zhì)作用的靶器官之一，卵巢細胞的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)與雌性的性腺發(fā)育和生殖功能有著密切的聯(lián)系。進一步的研究表明，凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化不僅涉及一系列復(fù)雜的級聯(lián)酶的生化反應(yīng)，也涉及到基因表達的差異及陽性和陰性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。卵巢凋亡細胞的調(diào)節(jié)是通過 Fas系統(tǒng)和 Bcl-2家族實現(xiàn)的［8-10］。Bcl-2家族蛋白被認為是調(diào)節(jié)線粒體中蛋白質(zhì)水平的主要物質(zhì)，它們可分為2類，一類具有抗細胞凋亡作用，如 Bcl-2、Bcl-W、Bcl-xl等，另一類具有促進細胞凋亡作用，如 Bax、Bim、Bcl-xS、Bod等。Bcl-2存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與線粒體膜上，它可通過抑制細胞凋亡誘導(dǎo)因子的釋放阻止細胞凋亡［11］。Hsu等［12］報道，當Bcl-2基因在轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢顆粒細胞的表達增加時，小鼠排卵率和產(chǎn)仔數(shù)顯著高于正常小鼠。另有研究表明，雞顆粒細胞轉(zhuǎn)染外源性Bcl-2可以減少第2代顆粒細胞凋亡的比例，這表明 Bcl-2可以抑制雞顆粒細胞凋亡［13］。Bcl-2基因在人類卵巢組織表達。在人類卵巢顆粒細胞的原代培養(yǎng)試驗中，Bcl-2在抑制細胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用。Bcl-2抑制細胞凋亡的機制尚不完全清楚。一些研究表明，Bcl-2蛋白和相關(guān)細胞器，特別是線粒體膜相關(guān)蛋白，可以通過干擾細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放或通過防止脂質(zhì)過氧化和抑制自由基的產(chǎn)生而抑制細胞凋亡［14-16］。在本研究中，采用不同劑量的GEN作用于PCOS大鼠卵巢顆粒細胞，隨著GEN劑量的增加，Bcl-2 mRNA表達增強，細胞凋亡明顯減少。

研究表明，在小鼠體內(nèi)的組織器官中，Bax比Bcl-2更廣泛地存在于肺、胃、淋巴結(jié)、脾、骨髓和其他組織中［17］。促進細胞凋亡的Bax蛋白可能與抗細胞凋亡的Bcl-2和Bcl-xl蛋白形成異源二聚體，從而引起B(yǎng)ax失去其促凋亡作用。當體內(nèi)有過多的Bax時會導(dǎo)致細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，當給予不同劑量的GEN時，大鼠卵巢顆粒細胞中Bax mRNA表達隨著GEN劑量的增加而減少，從而減少細胞凋亡。

GEN具有較強的抗氧化作用，能清除體內(nèi)的活性氧自由基，保護人體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、染色體免受活性氧的攻擊，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。對大鼠卵巢組織中抗氧化酶活性測定的結(jié)果表明，GEN不同劑量組的SOD活性均呈上升趨勢，高劑量組最為明顯。GEN通過抗氧化劑的還原作用直接給出電子而清除自由基，從而可升高CAT活性。另外，從中劑量組開始MDA含量呈下降趨勢，表明GEN可以通過雌激素樣作用降低卵巢組織中MDA含量，誘導(dǎo)酶活性防御系統(tǒng)消除老化的相關(guān)代謝產(chǎn)物，保護機體和細胞免受自由基損傷，進而發(fā)揮其抗氧化作用。

為了闡明PCOS的發(fā)病機制仍然有許多工作要做。本研究結(jié)果證實，細胞增殖和細胞凋亡在大鼠卵泡囊性改變中占有重要地位，GEN的雌激素樣作用能有效地調(diào)節(jié)PCOS大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax mRNA的表達量，關(guān)于其確切的作用通路還需要進一步的研究來確定。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，20 mg/kg GEN可以使抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表達量顯著增高，抑制促凋亡基因Bax mRNA表達，并且可調(diào)節(jié)卵巢組織中抗氧化酶的活性，其作用效果與雌激素相似，提示GEN可通過影響卵巢組織中細胞凋亡因子的表達而改善PCOS卵巢功能。

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