付亞杰，李長(zhǎng)棟，荔志云，季 瑋，孫建軍

低氧是臨床各種疾病中極常見的一類病理過(guò)程，腦的低氧也是導(dǎo)致機(jī)體死亡的重要原因之一。氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、神經(jīng)遞質(zhì)的毒性作用、相關(guān)酶類的變化、炎癥反應(yīng)、線粒體功能的異常、細(xì)胞凋亡等都是造成缺血低氧性腦損害的因素。異甘草素(ioshquiritigenin，ISL)為甘草中有效成分之一。文獻(xiàn)報(bào)道，異甘草素具抗脂質(zhì)過(guò)氧化［1］、松弛血管［2］、抑制血小板聚集、抗病毒、抗腫瘤［3］及雌激素樣活性［4］、抗細(xì)胞凋亡［5］等多種藥理作用。本研究采用體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，建立細(xì)胞低氧損傷模型，采用Flow cytometry方法檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡;采用RTPCR技術(shù)分析Bc1-2和Bax mRNA水平的表達(dá)變化，探討其對(duì)低氧神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

PC12細(xì)胞為蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

2 主要儀器和試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Revco公司);超凈工作臺(tái)(美國(guó)Sigma公司);低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(UNIVERSAL116型，德國(guó)Hetaeus公司):倒置相差顯微鏡(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司);紫外分光光度(德國(guó)Heraeus公司);潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD型，蘇州潔凈化設(shè)備有限公司);微量移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備上海有限公司):酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司);-80℃超低溫冰箱(MDF-381型，日本三洋有限公司);4℃冰箱(青島海爾公司):電子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司);電熱恒溫水箱(江蘇儀器廠);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，日本Olympus公司);水平電泳槽(北京六一儀器廠);胎牛血清(FBS)(購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司);異甘草素(天津馬克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品HPLC≥98%，批號(hào):GC-20120203);Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司);LDH檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司);SOD檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)。

3 PC12細(xì)胞的培養(yǎng)方法

將裝有PC12細(xì)胞的凍存管從液氮中取出，迅速投入37℃溫水中，邊震蕩邊觀察，在1min內(nèi)將凍存管中液體完全融化。超凈工作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞移入離心管，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基3～5ml，1000r/min離心5min，棄上清，加入4ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，吹打均勻，將細(xì)胞移入60mm培養(yǎng)皿中，于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第2d換液，棄掉未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%時(shí)，吸凈培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1遍，加入1ml 0．25%胰酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞圓縮，周邊折光性增強(qiáng)時(shí)，吸凈胰酶，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞均勻懸浮于培養(yǎng)液中，將細(xì)胞傳至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

4 ISL對(duì)正常PC12細(xì)胞形態(tài)及活力的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、突起較多的細(xì)胞，胰酶消化，1000r/min離心5min，棄上清，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×105個(gè)/ml，隨機(jī)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，四周邊孔加200μl PBS填充，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁。將實(shí)驗(yàn)組分為正常組，添加ISL組，后者分別加入終濃度為5、10、20、40、80μg/ml的ISL，每組5個(gè)復(fù)孔，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測(cè)不同濃度ISL對(duì)PC12細(xì)胞的影響。

5 細(xì)胞處理、分組與低氧模型建立

取對(duì)狀態(tài)良好、突起較多的細(xì)胞，胰酶消化，1000r/min離心5min，棄上清，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×105個(gè)/ml，隨機(jī)接種于96孔和6孔培養(yǎng)板中，96孔板每孔100μl，6孔板每孔1．5ml;之后分為C(對(duì)照組)、H(模型組，即單純低氧組)、H1(ISL低劑量組)、H2(ISL中劑量組)、H3(ISL高劑量組)，每組5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)C、H組不加入ISL，對(duì)H1、H2、H3組分別加入2、4、8μg/ml的ISL，加藥完成后放入低氧環(huán)境中培養(yǎng)，開始計(jì)時(shí)，按低氧后6、12、24h收取細(xì)胞，同時(shí)實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及給予的干預(yù)條件

低氧裝置為自制三氣通氣箱，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中，其內(nèi)充以95%N2+5%CO2混合氣體，外接傳感器來(lái)來(lái)控制氧含量，進(jìn)氣口裝有過(guò)濾膜，以此裝置制備PC12細(xì)胞低氧模型。

6 指標(biāo)檢測(cè)

6.1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)PC12細(xì)胞調(diào)亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次(1500rpm離心5min)，加入500μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15min，在1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。

6.2 RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2、Bax mRNA的變化 取各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞，提取總RNA，檢測(cè)RNA的完整性，檢測(cè)其濃度，取800ng總RNA進(jìn)行TaKaRa PrimeScript RT Master Mix試劑盒合成cDNA，反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為37℃15min，85℃5s。通過(guò)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μl，95℃3min，95℃10s，60℃30s，分別檢測(cè)Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)水平。

6.3 RT-PCR

(1)引物設(shè)計(jì)(大連寶生物服務(wù)有限公司合成)，基因和引物序列(5'-3')如下:

(2)反 應(yīng) 體 系:SYBR Premix10μl，引 物(25pmol/ul)0．6μl×2，cDNA 2μl，ddH2O 6．8μl;總體積20μl。

(3)反應(yīng)步驟:95℃，3min預(yù)變性;95℃，10s變性;60℃，30s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

正常狀態(tài)下分化的PC12表現(xiàn)出神經(jīng)元的特性，細(xì)胞形態(tài)為梭形、多角形，細(xì)胞突起長(zhǎng)，細(xì)胞胞膜光滑，細(xì)胞間建立突觸連接交聯(lián)成網(wǎng)狀(圖1)，傳代4h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞分裂迅速，每2～3d即可傳代，生命力旺盛，適于實(shí)驗(yàn)。

圖1 分化型PC12細(xì)胞(×400)

2 ISL對(duì)正常PC12細(xì)胞形態(tài)及活力旳影響

實(shí)驗(yàn)表明，ISL濃度在10μg/ml以下的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率與正常組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而20、40及80μg/ml劑量組對(duì)PC12細(xì)胞有一定的毒性作用(圖2)。因此我們選擇10μg/ml以下的3個(gè)劑量，即2、4、8μg/ml劑量作為給藥濃度并進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 MTT法測(cè)定ISL對(duì)正常PC12細(xì)胞活力的影響。不同濃度ISL培養(yǎng)48h，數(shù)據(jù)以±s表示，n=5;與未加藥組相比:＊＊P＜0．01

3 低氧對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響及ISL的作用

加入MTT培養(yǎng)4h后細(xì)胞內(nèi)生成藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(圖3)。左為模型組低氧24h后，出現(xiàn)多量的圓形“空泡”(如箭頭所示)，此為死亡的細(xì)胞，而在右圖，ISL 8μg/ml組低氧24h后，幾乎未見空泡形成，而且多數(shù)細(xì)胞仍保持正常形態(tài)，有突起，未聚集成團(tuán)。

圖3 加入MTT培養(yǎng)4h后生成藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜的情況(×400)。左為模型組，右為ISL 8μg/ml組

MTT結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞開始計(jì)時(shí)后即進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，細(xì)胞隨時(shí)間不斷分裂增殖，活力隨時(shí)間增強(qiáng);而模型組細(xì)胞活力明顯減弱;ISL組低氧后細(xì)胞活力較低氧組增強(qiáng)，細(xì)胞存活率增高，兩者之間有顯著性差異。ISL 8μg/ml組低氧24h效果最為顯著(表2)。

表2 ISL對(duì)PC12細(xì)胞低氧后細(xì)胞活力的影響(n=5,±s)

表2 ISL對(duì)PC12細(xì)胞低氧后細(xì)胞活力的影響(n=5,±s)

測(cè)定波長(zhǎng)為490nm，與低氧組比較:a P＜0．05

?

4 AnnexinⅤ/PI雙染檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡

細(xì)胞低氧損傷后，用AnnexinⅤ/PI雙染進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限為活細(xì)胞，右上象限顯示非活壞死細(xì)胞，右下象限為調(diào)亡細(xì)胞。檢測(cè)發(fā)現(xiàn):低氧24h后，模型組調(diào)亡細(xì)胞率(36．79±1．26)%較之正常組明顯增加，而ISL 8μg/ml組，其調(diào)亡細(xì)胞數(shù)量減少(17．52±1．03)%，活細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增多。提示ISL對(duì)低氧損傷引起的細(xì)胞調(diào)亡具有保護(hù)作用。此外，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞有些許調(diào)亡和壞死，可能與胰酶消化、吹打等操作損傷PC12細(xì)胞有關(guān)(表3、圖4)。

表3 低氧對(duì)PC12細(xì)胞調(diào)亡的影響以及ISL的作用(±s，n=5)

表3 低氧對(duì)PC12細(xì)胞調(diào)亡的影響以及ISL的作用(±s，n=5)

與對(duì)照組比較:##P＜0．001;與低氧組比較:＊＊P＜0．001

?

圖4 低氧對(duì)PC12細(xì)胞調(diào)亡的影響及ISL的作用。與對(duì)照組比較:##P＜0．001;與低氧組比較:＊＊P＜0．001

5 各組Bcl-2 mRNA表達(dá)變化

RT-PCR檢測(cè)低氧24h后細(xì)胞，單純低氧組Bcl-2 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組(P＜0．01)，加藥低氧組的Bcl-2 mRNA與模型組相比，表達(dá)均有所升高(P＜0．01)(圖5)。

圖5 各處理組Bcl-2 mRNA的表達(dá)變化(24h)。與對(duì)照組比較:##P＜0．001;與模型組比較:＊＊P＜0．001

6 各組Bax mRNA表達(dá)變化

低氧24h后，模型組Bax表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0．01)，加藥低氧組的Bax與模型組相比，表達(dá)均有所降低(P＜0．01)(圖6)。

圖6 各處理組Bax mRNA的表達(dá)變化(24h)。與對(duì)照組比較:##P＜0．001;與低氧組比較:＊＊P＜0．001

討 論

甘草是一種應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥?，F(xiàn)代藥理表明，甘草除具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗?jié)儭⒖棺儜B(tài)反應(yīng)等［6］作用外，還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［7］。ISL為甘草中有效成分之一，其化學(xué)名稱為4，2'，4'-三羥基查耳酮，為甘草中的一種有效單體，屬黃酮類化合物。

在神經(jīng)細(xì)胞低氧損傷的過(guò)程中，神經(jīng)元的壞死與凋亡同時(shí)發(fā)生，因此區(qū)別壞死和調(diào)亡的細(xì)胞就成為研究低氧損傷程度及ISL作用方式的重要內(nèi)容。本課題用Annexin V/PI雙染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度ISL作用下低氧細(xì)胞的調(diào)亡率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ISL可降低低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡，并有一定的濃度依賴性。

Bcl-2最初發(fā)現(xiàn)位于濾泡性淋巴瘤t(14，18)染色質(zhì)處，Bcl-2基因的表達(dá)產(chǎn)物主要位于線粒體膜、核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上［8］。當(dāng)細(xì)胞受到某種有害因素刺激出現(xiàn)病理改變時(shí)，它會(huì)發(fā)揮抗凋亡作用。Vaux等［9］首次報(bào)道Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存期。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞低氧時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生改變，致使一些因子成為誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的因素。研究發(fā)現(xiàn)，在受損傷的腦中Bcl-2可抑制神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，其表達(dá)增加可防止細(xì)胞受外界因素刺激后啟動(dòng)凋亡［10］。Bcl-2抑制缺血低氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷的可能機(jī)制有:降低細(xì)胞內(nèi)鈣［11］，阻斷Caspase依賴的內(nèi)在凋亡啟動(dòng)通路［12］，阻斷凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)依賴的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路［13］，抗氧化應(yīng)激作用［14］。1993年，Oltvai等［15］首先發(fā)現(xiàn)Bax基因作為一個(gè)調(diào)控Bcl-2的相關(guān)基因，與Bcl-2約有21%的氨基酸序列同源，故認(rèn)為Bax為Bcl-2家族成員。與Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡相反，Bax能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，它可能是通過(guò)形成Bcl-2-Bax復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Bax并不阻斷凋亡，而是對(duì)抗Bcl-2抑制凋亡的作用。Bcl-2家族蛋白通過(guò)調(diào)控線粒體途徑，對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用，其過(guò)程十分復(fù)雜，任何影響B(tài)cl-2以及Bax表達(dá)的因素均可影響細(xì)胞的凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氧損傷使PC12細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)下降，Bax mRNA表達(dá)升高，最終使PC12細(xì)胞走向凋亡。在低氧損傷中給予ISL，可升高PC12細(xì)胞Bcl-2 mRNA的表達(dá)，降低Bax mRNA的表達(dá)，Bcl-2通過(guò)激活抗凋亡機(jī)制，穩(wěn)定線粒體，減輕低氧細(xì)胞凋亡，這可能是ISL保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抗低氧損傷的機(jī)制之一。

本研究顯示，ISL能夠在基因?qū)用嫔险{(diào)Bcl-2 mRNA、下調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡。

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