童琛曄 馮原 蔣冰瑩 查黎萍 唐艷紅

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院手術(shù)室，上海200025）

為了建立符合我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的生物樣本庫(kù)，促進(jìn)生物樣本庫(kù)建設(shè)過(guò)程中的有益知識(shí)和技術(shù)方法的傳播，我院手術(shù)室聯(lián)合乳腺疾病診治中心于2012年起開(kāi)始研究并構(gòu)建上海及周邊地區(qū)早期乳腺癌生物樣本庫(kù)，用以完善乳腺癌相關(guān)臨床及基礎(chǔ)研究的進(jìn)行。我們參照2011年“中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)（試行）”（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“標(biāo)準(zhǔn)”），并結(jié)合自身的特點(diǎn)，制定了一套符合我們醫(yī)院的乳腺腫瘤生物樣本采集、保存的標(biāo)準(zhǔn)化流程（SOP）。我們探討不同溫度的無(wú)菌生理鹽水對(duì)采集乳腺腫瘤組織標(biāo)本的影響，建立更加規(guī)范的生物樣本采集、保存的SOP。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年10～12月乳腺癌腫瘤直徑≥2.5cm的組織標(biāo)本60例，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專(zhuān)人負(fù)責(zé)采集標(biāo)本。

1.2 材料準(zhǔn)備 上海長(zhǎng)征富民金山制藥公司生產(chǎn)的長(zhǎng)富牌無(wú)菌生理鹽水，500ml裝，玻璃瓶；潔定（GETINGE）公司加溫暖箱；三菱公司家用冰箱；海爾公司超低溫保存箱；滅菌溫度計(jì)；經(jīng)過(guò)處理的無(wú)RNA酶的刀片、眼科剪和尺、鑷子等；手套，口罩等標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)器材；其他材料：記號(hào)筆，標(biāo)簽，凍存管，采集標(biāo)本的操作臺(tái)等。

1.3 采樣方法 每次取樣前分別取無(wú)菌生理鹽水3瓶放于潔凈手術(shù)室室溫（22～26℃）、三菱公司冰箱冷藏室（4℃）、潔定公司加溫暖箱中（40℃），取材前準(zhǔn)備好標(biāo)有病例姓名縮寫(xiě)、住院號(hào)、腫瘤組織部位（T）、無(wú)菌生理鹽水漂洗液的溫度（C1、C2、C3）標(biāo)簽的凍存管。待標(biāo)本離體后，采集專(zhuān)員取出3瓶無(wú)菌生理鹽水并打開(kāi)，用滅菌溫度計(jì)分別測(cè)試3瓶生理鹽水的溫度，4～8℃的無(wú)菌生理鹽水標(biāo)記為C1，22～26℃的無(wú)菌生理鹽水標(biāo)記為C2，37～41℃的無(wú)菌生理鹽水標(biāo)記為C3。在標(biāo)本離體后的30min內(nèi)，更換器具切取腫瘤組織標(biāo)本的1／5，0.5cm×0.5cm×0.5cm，并平均分成3份，分別用C1、C2、C3的生理鹽水漂洗兩次以洗去血液與污漬，再分別裝入已編號(hào)的凍存管中，旋緊蓋子后放入-80°超低溫冰箱保存。于24h內(nèi)由專(zhuān)職人員將凍存管轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室由專(zhuān)職實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行標(biāo)本的總RNA提取鑒定。

1.4 鑒定標(biāo)準(zhǔn) 用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA樣品進(jìn)行量測(cè)，若吸光度ODZ60／OD280＞1.6，再用1%的瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)明顯的28s和18s條帶，若28s亮度比18s要高1～2倍，則表明RNA標(biāo)本保存完好[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用統(tǒng)計(jì)描述、χ2分析等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié)果（表1）

表1 不同溫度生理鹽水與腫瘤標(biāo)本質(zhì)量情況比較 （例）

表1提示，三組標(biāo)本RNA保存質(zhì)量有顯著性差異（P＜0.01），使用C1漂洗過(guò)的標(biāo)本RNA保存質(zhì)量最高。

3 討論

3.1 生理鹽水在采集乳腺腫瘤組織標(biāo)本中的作用

臨床生物樣本是基礎(chǔ)研究與臨床研究的寶貴資源，規(guī)范地采集、保存生物樣本可以避免樣本的損壞與流失，節(jié)約資源。根據(jù)“標(biāo)準(zhǔn)”中所提及的在采集標(biāo)本前需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行生理鹽水漂洗以去除其表面的血液及污物也是保證生物樣本質(zhì)量的一個(gè)重要手段。手術(shù)中的離體標(biāo)本不可避免有血液污染，血液也有其DNA／RNA，若不進(jìn)行漂洗而直接采集標(biāo)本，則可能導(dǎo)致將來(lái)抽取腫瘤標(biāo)本的DNA／RNA時(shí)，會(huì)受到血液DNA／RNA的影響，而影響最終的研究結(jié)果。如果采用其他溶液漂洗腫瘤標(biāo)本，如滅菌注射用水，則可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞腫脹破裂死亡，而最終無(wú)法抽取腫瘤細(xì)胞的DNA／RNA，無(wú)法開(kāi)展進(jìn)一步的研究。因此，對(duì)于腫瘤標(biāo)本漂洗溶液的選擇當(dāng)然是應(yīng)該選擇等滲、不影響腫瘤細(xì)胞活性、又不會(huì)添加其他成分的0.9%無(wú)菌生理鹽水。

3.2 不同溫度的生理鹽水對(duì)采集乳腺腫瘤組織標(biāo)本的影響 通過(guò)此次研究發(fā)現(xiàn)，用不同溫度生理鹽水漂洗腫瘤標(biāo)本，對(duì)標(biāo)本的采集、保存是有影響的。鑒定標(biāo)本的保存質(zhì)量主要看標(biāo)本的總RNA，并用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA樣品進(jìn)行檢測(cè)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)樣本取材時(shí)間對(duì)樣本RNA質(zhì)量存在著關(guān)鍵影響，眾多文獻(xiàn)推薦在樣本切除后30min內(nèi)取材[2-3]。因此，在此次實(shí)驗(yàn)中，我們嚴(yán)格控制取材時(shí)間＜30min，并由專(zhuān)人負(fù)責(zé)采集、送檢、檢驗(yàn)標(biāo)本，力求控制影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的所有變量，僅僅觀察用不同溫度生理鹽水漂洗后，標(biāo)本總RNA的質(zhì)量。由表1可看出，用不同溫度生理鹽水漂洗腫瘤標(biāo)本后，RNA保存質(zhì)量存在顯著性差異（P＜0.01），用冷的甚至是冰的生理鹽水漂洗腫瘤標(biāo)本更能完好的保存腫瘤細(xì)胞的RNA。這是因?yàn)闇囟仍降?，越有利于降低?xì)胞活性，避免腫瘤細(xì)胞基因組DNA、RNA和蛋白的降解。

3.3 建立乳腺腫瘤組織標(biāo)本采集、保存的標(biāo)準(zhǔn)化流程 參照“標(biāo)準(zhǔn)”，并結(jié)合此次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、自身的特點(diǎn)，我們制定了一套符合我們醫(yī)院的乳腺腫瘤生物樣本采集、保存的標(biāo)準(zhǔn)化流程。我們強(qiáng)調(diào)采集專(zhuān)員在取材前準(zhǔn)備好標(biāo)有病例姓名縮寫(xiě)、住院號(hào)、組織部位（T／P／N）的標(biāo)簽的凍存管和包埋盒，組織塊取下后，先用4～8℃的無(wú)菌生理鹽水漂洗標(biāo)本以去除血液與污漬。

綜上所述，在采集乳腺癌腫瘤組織標(biāo)本的過(guò)程中，使用4～8℃的無(wú)菌生理鹽水漂洗標(biāo)本后對(duì)腫瘤標(biāo)本的RNA保存質(zhì)量影響最小，可增添至生物樣本采集、保存的標(biāo)準(zhǔn)化流程中。

[1]《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6（1）：71-79.

[2]季加孚.北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院標(biāo)本庫(kù)的建設(shè)[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，37（3）：229-330.

[3]Mager SR，Oomen MH，Morente MM，et al."Standard operating produre for the collection of flesh frozen tissue samples[J].Eur J Cancer，2007，43（5）：828-834.