徐穎　李豪　修佳　等

[摘要]臨床藥物研究中對(duì)原料藥和制劑的含量測(cè)定日益嚴(yán)格，特別是中國(guó)藥典中對(duì)特殊物質(zhì)和有機(jī)雜質(zhì)的鑒別和分析日趨復(fù)雜，對(duì)一些治療窗口窄，安全范圍小的藥物進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)迫在眉睫，為優(yōu)化合成路線，提高藥品質(zhì)量，藥物分析技術(shù)的日新月異為藥物檢測(cè)提供保障。本研究對(duì)新型色譜聯(lián)用技術(shù)在分析領(lǐng)域進(jìn)行分析整理，了解色譜分析技術(shù)的特點(diǎn)和進(jìn)展，為藥物治療和物質(zhì)檢測(cè)提供科學(xué)指導(dǎo)。各種分析方法各獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在靈敏度，特征性，檢測(cè)速度各有所長(zhǎng)。采用色譜聯(lián)用技術(shù)，可以優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，將是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。色譜作為分離手段，光譜充當(dāng)鑒定工具，兩者取長(zhǎng)補(bǔ)短，已成為當(dāng)今分析領(lǐng)域中復(fù)雜成分樣品分析的主要方法。

[關(guān)鍵詞] 色譜聯(lián)用；藥物分析

[中圖分類號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）22-35-03

色譜技術(shù)（hyphenated techniques in chromatography，HTC）是將具有高分離效能的色譜技術(shù)與能夠獲得豐富化學(xué)結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù)相結(jié)合的現(xiàn)代分析技術(shù)。目前，隨著臨床藥理學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、生物藥劑學(xué)及治療藥物濃度監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，各種色譜聯(lián)用技術(shù)在藥品質(zhì)量、環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)、法醫(yī)學(xué)、商業(yè)檢驗(yàn)研究工作中成為最引人矚目的前沿技術(shù)之一。色譜技術(shù)因其理論的深入研究，技術(shù)的日異完善，儀器和組件的不斷更新，使其在分析領(lǐng)域顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。

1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）

氣相色譜與有機(jī)質(zhì)譜的聯(lián)用系統(tǒng)（GC-MS）是最早實(shí)現(xiàn)（1957年）的聯(lián)用儀。70年代，GC-MS已開始作為商品出售；80年代，已開始普及應(yīng)用；迄今技術(shù)日臻成熟，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、石油化工、環(huán)境保護(hù)和生命科學(xué)等領(lǐng)域。目前氣-質(zhì)聯(lián)用在聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用中十分活躍，它的成功應(yīng)用能使樣品的分離、鑒定和定量一次完成，毛細(xì)管氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)限已達(dá)10-9g～10-12g水平[1]。對(duì)于藥物分析的發(fā)展也起到了很大的促進(jìn)作用，例如GC-MS在合成產(chǎn)物的確證，有機(jī)合成反應(yīng)中副產(chǎn)物的鑒定，中藥未知成分的鑒定，藥物代謝物的研究等方面均是最重要的工具之一。

該方法利用了質(zhì)譜儀掃描快、靈敏度高的特點(diǎn)，而且用電子轟擊離子源（EI）所獲得的質(zhì)譜，碎片信息量大，重復(fù)性好。因此GC-MS聯(lián)用儀多具有10萬(wàn)或幾十萬(wàn)張質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫(kù)，以供比對(duì)定性。氣相色譜儀可以看作是質(zhì)譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)，相反也可以把質(zhì)譜儀看作是色譜儀的檢測(cè)器。因質(zhì)譜儀

靈敏度高、特征性強(qiáng)、要求分析試樣必須是高度純凈物（除MS-MS聯(lián)用技術(shù)外），色譜技術(shù)為質(zhì)譜分析提供了色譜純化的試樣，質(zhì)譜儀則提供準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息。

雖然GC-MS聯(lián)用儀是最成熟的聯(lián)用裝置，但由于受樣品的揮發(fā)性限制或極性的影響，分析前常常需要衍生化處理后再分析，因此使用范圍不如LC-MS廣泛。但在其分析范圍內(nèi)該法具有高分辨能力和高靈敏度，仍然是分析工作者經(jīng)常選擇的方法。

2 高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是90年代發(fā)展成熟的分析技術(shù)，它集HPLC的高分離能力與MS的高靈敏度、極強(qiáng)的結(jié)構(gòu)解析能力、高度的專屬性和通用性、分析速度快于一體，已成為藥品質(zhì)量控制（包括藥物中微量雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、藥物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析鑒定）、藥用植物成分分析、體內(nèi)藥物和藥物代謝研究中其它方法所不能取代的有效工具[2]。HPLC法可以分離的化合物范圍遠(yuǎn)較GC法為大，與GC-MS聯(lián)用技術(shù)相比較，GC法對(duì)樣品的極性和熱穩(wěn)定性有一定要求，因此在GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析前，樣品的預(yù)處理極為重要。LC-MS聯(lián)用分析前樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，一般不要求水解或者衍生化，可以直接用于藥物及其代謝物的同時(shí)分離和鑒定。LC-MS技術(shù)集液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和極強(qiáng)的定性、專屬性于一體，成為其他方法所不能取代的有效分析工具：（1）樣品適用范圍寬。一般不要求水解或者衍生化處理，即可直接用于檢測(cè)強(qiáng)極性化合物，如結(jié)合型代謝產(chǎn)物。LC-MS可測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量范圍很寬，一般為50～2000m/z，有的儀器可達(dá)50～6000m/z，而且能夠檢測(cè)多種結(jié)構(gòu)的化合物。（2）檢測(cè)靈敏度高。能夠?qū)?fù)雜基質(zhì)中痕量的組分進(jìn)行定性和定量分析。（3）可提供結(jié)構(gòu)信息。通過軟電離方式，一級(jí)質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰和加合離子峰可以給出分子量信息。（4）利用碰撞誘導(dǎo)裂解能夠進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜分析，可提供豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。HPLC-MS的不足主要為：（1）由于離子化問題，對(duì)部分化學(xué)成分的響應(yīng)差，不能分析所有結(jié)構(gòu)類型的化合物。（2）對(duì)色譜流動(dòng)相的組成有限制，不宜使用非揮發(fā)性緩沖鹽，揮發(fā)性緩沖鹽的濃度也應(yīng)控制在10mmol/L以下，在一定程度上降低了LC-MS的應(yīng)用范圍。（3）所提供的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息尚不足以徹底解決化合物的鑒定問題，尤其對(duì)闡明化合物的基團(tuán)連接位置和立體構(gòu)型等缺乏證據(jù)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，LC-MS技術(shù)還可能得到進(jìn)一步發(fā)展。

3 電噴霧離子-質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）

ESI-MS是由 Yamashita和Fenn在1984年發(fā)明的一種大氣壓電離技術(shù)[3]，在大氣壓狀態(tài)下各種物質(zhì)以液體狀態(tài)通過各種接口進(jìn)樣，離子蒸發(fā)各種物質(zhì)，進(jìn)樣液滴直徑變小，表面離子化加大，電荷密度增加，揮發(fā)度高的離子優(yōu)先從樣孔射出，進(jìn)入氣相，形成的離子樣品通過錐孔、聚焦透鏡進(jìn)入質(zhì)譜儀隨后被檢測(cè)出來(lái)。其特點(diǎn)是：（1）離子聚集、離子活化，離子肼產(chǎn)生，質(zhì)荷比分析等都在一個(gè)空間中進(jìn)行，離子傳輸損失減少，碎片峰的干擾大幅減少；（2）通過電噴霧離子化后，樣品進(jìn)入質(zhì)譜儀的性態(tài)多樣性，有單電荷的準(zhǔn)分子離子，有多電荷的生物大分子，包括蛋白質(zhì)、酶類、核酸和多肽等，在質(zhì)譜圖上呈現(xiàn)多電荷特征離子峰圖，特征峰突出，使檢測(cè)分析質(zhì)量大幅提高，檢測(cè)范圍擴(kuò)大，在藥物篩選、農(nóng)藥檢測(cè)、中藥成分鑒定等應(yīng)用前景廣闊。（3）靈敏度高，可以檢測(cè)10-8M以下的物質(zhì)，微量物質(zhì)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯。（4）既可以定性，又可以定量分析，可提供檢測(cè)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量的詳細(xì)信息，對(duì)于復(fù)雜混合物的分析優(yōu)勢(shì)明顯。有學(xué)者應(yīng)用ESI-MS技術(shù)對(duì)三氯苯達(dá)唑原料藥、克林霉素有關(guān)物質(zhì)、長(zhǎng)春花生物堿、蓮子心生物堿進(jìn)行研究分析[4]，均取得很好的分離作用，質(zhì)譜圖出峰時(shí)間短，峰形尖銳，效果明顯，實(shí)驗(yàn)證明ESI-MS技術(shù)對(duì)藥物分析手段限制小，應(yīng)用范圍廣闊，在快速鑒定微量物質(zhì)方面前景廣闊。endprint

4 高速逆流色譜技術(shù)（HSCCC）

HSCCC是由美國(guó)國(guó)立健康研究院Ito Y博士等研發(fā)出來(lái)的新型液液分配技術(shù)[5]，其原理為：不用任何固體作載體，互不相容的兩相溶劑在繞成線圈的聚四氟乙烯管內(nèi)做高速行星式運(yùn)轉(zhuǎn)，當(dāng)螺旋管分離柱繞公軸以800r/min高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，靠近公軸的兩相溶劑混合，遠(yuǎn)離共軸的兩相溶劑靜置分層，達(dá)到流動(dòng)力學(xué)平衡時(shí)，開始進(jìn)樣，樣品在兩相反復(fù)快速分離混合，最終按照分配系數(shù)的大小依次洗脫，從而達(dá)到分離的目的。隨著分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，又開發(fā)出正膠軸色譜分離技術(shù)（CCC）[6]，雙向逆流色譜技術(shù)（DuCCC）[7]，PH-區(qū)帶精制逆流色譜技術(shù)（PH zone refining CCC）[8]，它們?cè)谛D(zhuǎn)原理，固定相和流動(dòng)相的選擇，解離常數(shù)和疏水性的不同各具優(yōu)勢(shì)，對(duì)分離天然大分子蛋白、復(fù)雜成分中藥分離、食品藥品檢測(cè)和環(huán)境污染檢測(cè)都發(fā)揮不可替代的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者使用這項(xiàng)技術(shù)分離提純檢測(cè)黃酮類化合物，農(nóng)藥殘留，篩選活性物質(zhì)等[9-11]都取得理想的分離目的。分析型HSCCC還可以與光譜或色譜連用，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，建立中藥指紋圖譜，確定化合物分子結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要作用。HSCCC以其分辨率高，洗脫方式多樣，重現(xiàn)性好，與其他分析儀兼容性強(qiáng)，性能可靠在天然藥物研究中發(fā)揮重要作用。

5 免疫親和色譜技術(shù)（LAC）

免疫親和色譜技術(shù)是利用含偶聯(lián)抗體的固定相做親和層析住，選擇性可逆吸附待測(cè)物抗原物質(zhì)，達(dá)到從復(fù)雜化合物中分離提純目標(biāo)物的目的[12]。在LAC應(yīng)用中，有目的依據(jù)不同化合鍵作用原理，有目的的選擇親和配位體，發(fā)揮對(duì)目標(biāo)分子獨(dú)特的親和能力，識(shí)別特征物質(zhì)?？赏瑫r(shí)進(jìn)行篩選天然藥物的活性成分和不同成分的分離[13]。利用被測(cè)物質(zhì)反應(yīng)原性，待測(cè)物質(zhì)粗提液流經(jīng)免疫吸附柱時(shí)，對(duì)抗體有特殊親和力的抗原物質(zhì)吸附到色譜柱，使被測(cè)物質(zhì)選擇性的提取和濃縮[14-15]。其特點(diǎn)是：（1）專屬性、選擇性強(qiáng)，只有特定的抗原抗體復(fù)合物可以識(shí)別；（2）提純、富集效果好，由于只對(duì)特性集團(tuán)產(chǎn)生吸附作用，操作簡(jiǎn)便，分離度高。（3）可重復(fù)使用，對(duì)色譜柱毒化作用低，可反復(fù)活化使用。現(xiàn)與其他色譜技術(shù)聯(lián)合分析方法多種，固定化金屬親和色譜（IMAC），凝集素親和色譜（ALAC），細(xì)胞膜親和色譜（CMC），分子烙印親和色譜（MIC）等[16]。親和色譜技術(shù)應(yīng)用廣泛，純化分離天然藥物活性蛋白，篩選天然藥物活性成分，對(duì)天然藥物質(zhì)量控制，研究天然藥物作用機(jī)制等都發(fā)揮都特作用。

6 近紅外光譜（NIRS）技術(shù)

近紅外光譜（near-infrared spectrophotometry，NIRS）是一種用于鑒定有機(jī)物質(zhì)十分有用的技術(shù)。近紅外光譜是中紅外光譜（mid-infrared spectrum，MIRS；2500～25000nm）中C-H，N-H，O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波長(zhǎng)范圍為780～2526nm（12820～3959cm-1），而且該光譜取決于粒子大小、多晶型、殘留溶劑、濕度等等因素，因此待測(cè)物光譜的鑒定不可能直接與參比物質(zhì)光譜比較后確定，常常需要將所得數(shù)據(jù)經(jīng)合適有效的數(shù)學(xué)處理后方能進(jìn)行[17]。近紅外光譜技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、無(wú)需耗損樣品和化學(xué)試劑，及易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)分析等特點(diǎn)[18]。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，在藥物分析領(lǐng)域得到愈益廣泛的應(yīng)用。

藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)是運(yùn)用在藥品檢驗(yàn)上一項(xiàng)新的技術(shù)，這一新技術(shù)的研究和發(fā)展對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)假劣藥品發(fā)揮著重要的作用。運(yùn)用快檢技術(shù)是現(xiàn)場(chǎng)檢查中提供發(fā)現(xiàn)假劣藥品的初篩手段和方法，同時(shí)對(duì)可疑藥品進(jìn)行暫控，大大縮短了抽檢周期。同時(shí)也節(jié)省了資源，提高了監(jiān)督抽驗(yàn)的陽(yáng)性率，而且可以防止假劣藥品的轉(zhuǎn)移和流失，有效的打擊不法分子，為廣大人民群眾用藥安全有效做出很大貢獻(xiàn)，進(jìn)一步凈化了我們的藥品市場(chǎng)。目前近紅外快速鑒別系統(tǒng)具有400多個(gè)通用定性分析模型，40個(gè)定量分析模型，基本可以滿足市場(chǎng)中的常見藥品快速篩查[19]?；瘜W(xué)系統(tǒng)鑒別法將常用的13類化學(xué)藥品按其結(jié)構(gòu)分別建立了37個(gè)鑒別系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同系物藥物的互相區(qū)分，可以對(duì)各類制劑的560余種藥品實(shí)行快速鑒別。中成藥化學(xué)快速鑒別系統(tǒng)可對(duì)182種中成藥實(shí)現(xiàn)了快速鑒別。中藥材快速鑒別系統(tǒng)已經(jīng)建立了230種中藥材的快檢方法[20]；藥品信息查詢技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)19余萬(wàn)條藥品質(zhì)量信息數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)查詢。

藥物分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，為臨床藥物檢測(cè)，中藥復(fù)雜成分分析，食品安全環(huán)境污染檢測(cè)提供保障。色譜技術(shù)正朝著聯(lián)用化，智能化，微量化，自動(dòng)化發(fā)展。隨著各個(gè)學(xué)科不斷滲透，更多新的色譜技術(shù)還會(huì)不斷涌現(xiàn)，檢測(cè)手段也會(huì)日益豐富。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李娟，任路靜，孫冠男，等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在代謝組學(xué)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2013（4）：434-446.

[2] Kaiser P，Akerboom T，Wood WG.A novel LC-DMS/MS method for the determination of the cardiac glycosides digoxin and digitoxinusing caesium adducts[J].Clin Lab，2006，1-2（52）：37-42.

[3] Yamashita M，F(xiàn)enn JB.Electrospray ion source：Another variation on the free-jet theme[J].J Phy Chem， 1984，88：4450.

[4] 周慧.電噴霧質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用[D].杭州：浙江大學(xué)，2005：12-13.

[5] Ito Y.New continous extraction method with a coil pianet centrifuge[J].J Chromatogr，1981，207：161-170.endprint

[6] 黃寶康，秦路平，鄭漢臣，等.高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離及中藥質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中藥材，2001（10）：757-761.

[7] 陳亞麗.反相氣相色譜技術(shù)表征咪唑基離子液體物化性質(zhì)的方法學(xué)研究[D].烏魯木齊：新疆大學(xué)，2013：37-38.

[8] 陳建蘭，李慶山，王漢平，等.變性高效液相色譜技術(shù)定量檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病FLT3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)突變方法學(xué)的建立[J].中國(guó)病理生理雜志，2011，27（9）：1852-1856.

[9] 邸多隆，鄭媛嬡，陳小芬，等.高速逆流色譜技術(shù)分離純化天然產(chǎn)物中黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].分析化學(xué)，2011，39（2）：269-275.

[10] 歐霞，李勁平，佘志堅(jiān)，等.高速逆流色譜法在天然藥物研究中的應(yīng)用概況[J].中南藥學(xué)，2014（3）：246-250.

[11] 黃寶康，秦路平，鄭漢臣，等.高速逆流色譜技術(shù)在天然產(chǎn)物分離及中藥質(zhì)控中的應(yīng)用[J].中藥材，2001（10）：757-761.

[12] 張丹妍，馬明福，張丹媚，等.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性高效液相色譜技術(shù)在唐氏綜合征篩查中的應(yīng)用[J].癌變·畸變·突變，2012（1）：71-74.

[13] 吳笑春，高月.時(shí)間分辨熒光免疫分析法在血液地高辛濃度分析中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，1994（2）：83-85.

[14] 劉望才，朱家文.親和色譜技術(shù)研究進(jìn)展[J].上海化工，2007，32（4）：27-29.

[15] 王煒，侯艷.淺談免疫親和色譜技術(shù)的應(yīng)用[J].黑龍江科技信息，2012（7）：113-114.

[16] 陳芳有，羅永明，吳樣明，等.親和色譜技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（11）：230-234.

[17] 謝青.現(xiàn)代色譜技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用[J].海峽藥學(xué)，2007，19（11）：95-98.

[18] 丁東.近紅外光譜技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2004.

[19] 孫學(xué)惠，郭濤，劉濤，等.藥物檢測(cè)新技術(shù)在藥代動(dòng)力學(xué)中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2002，13（9）：566-567.

[20] 雷利利，張熙潔，侯林中，等.現(xiàn)代色譜技術(shù)在中藥制劑多指標(biāo)成分質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2011，22（39）：3733-3735.

（收稿日期：2014-08-02）endprint