寧映霞，鄧宇傲，曹建國(guó)

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120;2. 深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020;3. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

卵巢癌上皮癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是最致命的婦科惡性腫瘤之一。鑒于EOC 臨床癥狀不典型，所以，約70%患者在確診時(shí)已處于晚期(Ⅲ、Ⅳ期)，5年生存率約15% ～30%［1］。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和化療等初期治療有效［2］，但80% ～85%的病例會(huì)出現(xiàn)耐藥及復(fù)發(fā)。因此，尋找治療卵巢癌的候選藥物，具有十分重要的臨床治療學(xué)意義。

新近研究表明飲食源性黃酮類(lèi)化合物，如姜黃素［3］、槲皮素［4］、金雀異黃素［5］等具有抑制腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)自我更新能力作用。在本文的研究中，我們集中研究新型金雀異黃素類(lèi)似物即7-二氟甲氧基-5，4'-二正辛烷基金雀異黃素(DFOG)是如何抑制人卵巢癌A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

DFOG(分子量:544，性狀:黃色粉末，純度:98%)參照文獻(xiàn)［6］方法制備;DMSO(上海安瑪西亞公司)。MTT(美國(guó)sigma 公司)。鼠抗人CD133、CD44、FoxO3a、β-actin 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和試劑

人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海市)。細(xì)胞在添加10% 胎牛血清(FBS)、100 IU/mL 青霉素G 和100 μg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 中，置37 ℃、飽和濕度的5% CO2培養(yǎng)箱中單層貼壁生長(zhǎng)。

成球培養(yǎng):收集細(xì)胞、洗滌、去血清。然后，將收集的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在添加100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、20 ng/mL 人重組表皮生長(zhǎng)因子(hrEGF)、10 ng/mL 人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hrbFGF)、2%不含維生素A 的B27 以及1% N2添加物(美國(guó)Invitrogen 公司)的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中。細(xì)胞以1000 細(xì)胞/孔的密度接種于超低粘附6 孔板(美國(guó)Corning 公司)。每周2 次更換培養(yǎng)基或添加2 次生長(zhǎng)因子。

體外連續(xù)成球培養(yǎng):溫和離心收集細(xì)胞，并將細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液，然后懸浮培養(yǎng)，使其再生成新腫瘤球。第三代腫瘤球形成細(xì)胞被用于后續(xù)試驗(yàn)。

為了研究單細(xì)胞再次形成新腫瘤球的百分率，細(xì)胞以1000 細(xì)胞/孔的密度接種到6 孔板上以獲得新腫瘤球。培養(yǎng)8 天后，計(jì)數(shù)腫瘤球總數(shù)。腫瘤球形成率以下列公式計(jì)算:腫瘤球總數(shù)/接種總活細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 MTT 測(cè)定

按照先前文獻(xiàn)［7］的方法，將源自A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞和親本細(xì)胞以5000 個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種在預(yù)先包被基質(zhì)膠的96 孔板中。細(xì)胞暴露在濃度逐漸增加的DFOG 中。48 h 后，每孔按產(chǎn)商的說(shuō)明添加MTT 試劑。在570nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

1.4 Western blot 分析

按先前文獻(xiàn)［7］描述的方法完成Western blot 分析。細(xì)胞通過(guò)4℃條件下在裂解液中孵育20 min 裂解。Bio-Rad 含量測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍子肧DS-PAGE 分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上?？笷oxO3a、抗CD133、抗CD44、抗β-actin 抗體被用作一抗。使用ECL 高級(jí)蛋白印記分析系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS15.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析和處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單因素方差分析進(jìn)行多組均數(shù)比較，使用LSD 分析進(jìn)行兩兩比較。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候使用雙側(cè)t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A2780 細(xì)胞系球形成能力測(cè)定

我們用干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)A2780 卵巢癌細(xì)胞系細(xì)胞8 天，得到由50 ～100 細(xì)胞構(gòu)成的腫瘤球(圖1)。在A2780 細(xì)胞系第三代球形成細(xì)胞中，39.4%單個(gè)細(xì)胞形成新腫瘤球。此外，腫瘤球形成細(xì)胞能夠在體外連續(xù)傳代12 次以上。這些結(jié)果說(shuō)明:A2780 細(xì)胞系SFCs 具有自我更新特性。

圖1 人卵巢上皮癌A2780 細(xì)胞系腫瘤球形成

2.2 A2780 細(xì)胞系SFCs 干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)分析

為了進(jìn)一步鑒定A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞(SFCs)是否具有干細(xì)胞特性，我們用蛋白印跡法對(duì)比檢測(cè)SFCs 與親本細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)。從圖2 可見(jiàn):CD133、CD44 蛋白表達(dá)水平在A2780 細(xì)胞系SFCs 中增高。

圖2 人卵巢癌A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞與親本細(xì)胞CD133 和CD44 蛋白表達(dá)的比較

2.3 DFOG 對(duì)A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞增殖的影響

不同劑量的DFOG(0.0 ～10.0 μM)處理A2780細(xì)胞系第3 代球形成細(xì)胞或親本細(xì)胞48 小時(shí)，MTT比色測(cè)定結(jié)果證實(shí):DFOG 呈濃度依賴(lài)性?xún)?yōu)先抑制SFCs 的細(xì)胞增殖活性(圖3);其對(duì)SFCs 和親本細(xì)胞的IC50值分別為0.47 μmol/L 和10.9 μmol/L。

2.4 DFOG 對(duì)A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新的影響

金雀異黃素(10.0 μM)和DFOG(0.1，1.0，10.0 μmol/L)作用48h 顯著降低A2780 細(xì)胞系SFCs 腫瘤球形成率，呈濃度依賴(lài)性(圖4)。這些數(shù)據(jù)顯示DFOG 能有效抑制A2780 細(xì)胞系SFCs 自我更新能力。

圖3 DFOG 對(duì)人卵巢癌A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞與親本細(xì)胞增殖的影響

圖4 DFOG 對(duì)人卵巢癌A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞自我更新能力的影響

2.5 DFOG 降低FoxO3a 磷酸化水平

Western Blot 結(jié)果顯示:A2780 細(xì)胞系SFCs 具有更高的FoxO3a 磷酸化蛋白表達(dá)水平，提示存在FoxO3a 的失活(圖5);特別值得注意的是:DFOG能有效降低SFCs 磷酸化FoxO3a 蛋白水平和干細(xì)胞標(biāo)志物CD133 和CD44 蛋白表達(dá)(圖6)。

圖5 卵巢癌A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞與親本細(xì)胞FoxO3a 磷酸化水平的比較

圖6 DFOG 降低卵巢癌A2780 細(xì)胞系球形成細(xì)胞FoxO3a磷酸化水平和下調(diào)CD133 與CD44蛋白表達(dá)

3 討論

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源。卵巢上皮癌對(duì)目前的化療缺乏敏感性，因此，尋求針對(duì)卵巢癌干細(xì)胞(ovarian cancer stem cells，OCSCs)的靶向治療藥物，對(duì)克服臨床上現(xiàn)有治療手段的缺陷，改善卵巢癌患者的預(yù)后有重要意義。

大量研究證據(jù)表明飲食來(lái)源黃酮類(lèi)化合物是靶向CSCs 有前途的化學(xué)預(yù)防藥物，如金雀異黃素［3-5］。因此，本文檢測(cè)新型金雀異黃素類(lèi)似物DFOG 是否能抑制OCSCs 自我更新作用。通過(guò)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法，我們得到A2780 細(xì)胞系SFCs;證實(shí) SFCs 高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133+、CD44+;并且在體外具有自我更新能力。這些結(jié)果說(shuō)明A2780 細(xì)胞系SFCs 具有卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性。特別重要的是:我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):DFOG 具有抑制源自A2780 細(xì)胞的卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖活性和自我更新能力作用。這些研究結(jié)果為DFOG 靶向治療卵巢癌的臨床前和臨床評(píng)價(jià)提供了具有說(shuō)服力的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

Sunayama 等人的研究顯示:FoxO3a 是整合神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子;并且被認(rèn)為其作為治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)［8］。在本文的研究中，我們發(fā)現(xiàn)DFOG 抑制A2780 細(xì)胞系SFCs 增殖活性和自我更新能力，同時(shí)，伴隨著FoxO3a 蛋白磷酸化水平和干細(xì)胞標(biāo)志物CD133 與CD44 蛋白表達(dá)水平的降低;從而提示DFOG 可能通過(guò)活化FoxO3a 轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而抑制A2780 細(xì)胞系SFCs 自我更新和干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)?？傊覀兊难芯孔C實(shí):DFOG 具有抑制人卵巢癌A2780 細(xì)胞系腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖和自我更新作用。此外，活化FoxO3a 可能是這些作用的機(jī)制之一。

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