厲碧榮，李 劼，王靜云，楊小紅

(1.湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院老年病科，湖南 長沙 410005;2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410006)

卵巢癌是全世界婦女死亡率最高的惡性腫瘤之一。盡管順鉑和紫杉醇等藥物初次治療具有高達(dá)80%的有效率，但是，高復(fù)發(fā)率和多藥耐藥等原因?qū)е侣殉舶┗颊?年生存率不超過30%［1］。近來的研究表明，卵巢癌治療后的高復(fù)發(fā)率和藥物耐受性歸因于現(xiàn)有化療藥物沒有能夠消除具有干細(xì)胞性質(zhì)的卵巢癌細(xì)胞即卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞［2］。卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的一個(gè)重要特征是具有自我更新即干細(xì)胞培養(yǎng)基超低粘附板培養(yǎng)腫瘤球形成能力［3］。

紫花牡荊素(casticin，CAS)系傳統(tǒng)中藥蔓荊子的主要抗腫瘤有效成分。有研究證實(shí)CAS 具有抑制肝癌干細(xì)胞和肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新作用［4-5］。本文的研究檢定CAS 能否有效抑制人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系腫瘤球形成，并探討其作用的潛在機(jī)制是否涉及下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44 蛋白表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

CAS 由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院曹建國教授惠贈(zèng)，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定純度為0. 958。鼠抗人CD44 單克隆抗體為美國Cell signaling 公司產(chǎn)品;鼠抗人β-actin 單克隆抗體系美國Sigma 公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞系與成球培養(yǎng)

人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海市)。參照文獻(xiàn)［6］的方法進(jìn)行常規(guī)單層貼壁細(xì)胞生長培養(yǎng)和干細(xì)胞培養(yǎng)基超低粘附板懸浮培養(yǎng)。

1.3 Western Blot 分析

按照文獻(xiàn)［6］的方法制備全細(xì)胞提取物。Bradford 試驗(yàn)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。在PBST 中，用脫脂牛奶5%(w/v)進(jìn)行封閉PVDF 膜，鼠抗人CD44 單克隆抗體作為一抗，4 ℃條件孵育過夜。用過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育PVDF 膜1 h。以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Biosciences)對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。用鼠抗人β-actin 單克隆抗體作為加樣量對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Spss15.0 for windows evaluation軟件(SPSS Inc，Chicago，IL)，建立數(shù)據(jù)庫，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，用One Way ANOVA 方式行方差分析。各組均數(shù)間的兩兩比較用LSD 法。P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAS 對(duì)卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系腫瘤球形成的影響

體外人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系細(xì)胞呈單層貼壁生長(圖1A)。干細(xì)胞培養(yǎng)基超低粘附板培養(yǎng)OVCAR-3 細(xì)胞系細(xì)胞6 天，形成非粘附克隆性三維細(xì)胞球體(圖1B)，其腫瘤球形成率為3. 16%。CAS(1.0、3.0、10.0 μmol/L)作用48 h，有效減少OVCAR-3 細(xì)胞系腫瘤球形成數(shù)量(圖1C)。

圖1 紫花牡荊素抑制人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系腫瘤球形成(mean±SD，n=6)

2.2 人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞高表達(dá)CD44 蛋白

Western Blot 分析結(jié)果顯示:與親本細(xì)胞比較，人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物CD44 蛋白表達(dá)水平增高(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞與親本細(xì)胞CD44 蛋白表達(dá)的比較(mean±SD，n=3)

2.3 CAS 對(duì)卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系腫瘤球形成CD44 蛋白表達(dá)的影響

圖3 可見:CAS(1.0、3.0、10.0 μmol/L)孵育24 h，人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞CD44 蛋白表達(dá)水平明顯降低，呈濃度依賴性(P ＜0.05)。

圖3 紫花牡荊素下調(diào)人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞CD44 蛋白表達(dá)(mean±SD，n=3)

3 討論

新近的研究證實(shí):人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞具有CD44 + CD24low細(xì)胞表型和自我更新、高致瘤性等卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性［7］。與該研究結(jié)果相一致，在本文的實(shí)驗(yàn)研究中，我們采用干細(xì)胞培養(yǎng)基超低粘附板懸浮培養(yǎng)OVCAR-3 細(xì)胞系細(xì)胞6 天，得到非粘附克隆性腫瘤球形成細(xì)胞;并用Western Blot 分析證明OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44 蛋白。從而進(jìn)一步證明OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞具有卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性。

CAS 是一種被證明具有抗腫瘤活性的多甲氧基黃酮類化合物［8］，新近的實(shí)驗(yàn)有研究提示CAS 能有效抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新能力［4-5］。本文的研究結(jié)果顯示，CAS 能有效人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系腫瘤球形成能力，突出了CAS 是一種靶向抑制腫瘤干細(xì)胞功能和特性候選藥物的潛在應(yīng)用前景。

已有研究提示細(xì)胞表面CD44 即透明質(zhì)酸受體表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞自我更新性質(zhì)和藥物耐受性相關(guān)［9］。本文用Western Blot 分析的結(jié)果證實(shí)，CAS以濃度依賴方式下調(diào)人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系球形成細(xì)胞CD44 蛋白表達(dá)。因此，我們作出如下推斷:CAS 具有抑制人卵巢癌OVCAR-3 細(xì)胞系自我更新作用，其作用分子機(jī)制與下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44 蛋白表達(dá)有關(guān)。

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