張 方， 李漢全， 楊建遠(yuǎn)， 張炳火

(1.九江市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，江西 九江332000;2.九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江332000)

藍(lán)藻水華已經(jīng)成為世界性的嚴(yán)重環(huán)境問題［1-2］，中國尤為突出［3-4］。由于環(huán)境污染和全球氣候變暖等因素，水華暴發(fā)更為頻繁［5］，危害也越來越嚴(yán)重。目前藍(lán)藻水華防治方法主要有化學(xué)藥品(如Cu-SO4)殺滅法、物理方法(如黃土和黏土顆粒吸附除藻、機(jī)械除藻和超聲波除藻等)、以浮游動物和鰱鳙等魚類為主的生物操縱法以及用病毒、細(xì)菌等微生物控藻的方法等［6-10］。

硫酸銅等化學(xué)藥品控制水華雖然快速高效［11］，但會導(dǎo)致水環(huán)境二次污染［12-13］;黃土和黏土顆粒等吸附效果好，但會導(dǎo)致底棲生物二次影響［14］，且大面積應(yīng)用尚有許多困難［15］;而超聲波等其他物理方法處理能力有限，只能作為輔助手段［16］;生物操縱必須在一定營養(yǎng)濃度、水體規(guī)模等條件下才能取得良好效果，且效果不是特別穩(wěn)定［17］，而且有研究者認(rèn)為，養(yǎng)魚加速了水體的富營養(yǎng)化，因?yàn)轸~類的攝食與排泄造成了營養(yǎng)短路代謝，特別是加速了磷的活化過程［18］，因此生物操縱法難以解決大面積水華問題。

以微生物為主的生物防治法因其環(huán)境友好，近年來受到了越來越廣泛的關(guān)注［19-22］，是目前藍(lán)藻水華防治研究的熱點(diǎn)之一。產(chǎn)生天然活性產(chǎn)物殺藻是微生物殺藻的重要機(jī)制之一。天然產(chǎn)物具有高效、環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)和容易降解等優(yōu)點(diǎn)，是潛在的優(yōu)良?xì)⒃鍎?。放線菌是一類主要呈絲狀生長的原核生物，其代謝產(chǎn)物極其豐富，目前發(fā)現(xiàn)的具有生理活性的微生物次級代謝產(chǎn)物約有45%來源于放線菌［23］，即使是被廣泛研究的鏈霉菌也有97%的代謝產(chǎn)物未被人們發(fā)現(xiàn)［24］。因此，從放線菌中篩選高效環(huán)保的藍(lán)藻水華防治劑是值得深入研究的領(lǐng)域。本試驗(yàn)擬初步研究一株溶藻放線菌及其代謝產(chǎn)物的溶藻效率、溶藻活性成分的部分性質(zhì)及溶藻菌株的分類地位等，旨在為該菌在藍(lán)藻水華防治上的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種與放線菌來源

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosaFACHB-905)，中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。供試放線菌JXJ-0110，是九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從廬山土樣中分離獲得。

1.2 銅綠微囊藻的培養(yǎng)

(1)液體培養(yǎng)，以HGZ 為銅綠微囊藻培養(yǎng)基，溫度為27 ℃，光照度為3 000 lx，光暗比為12 h ∶12 h，靜置培養(yǎng)，每天搖動4 次，每次30 s。(2)銅綠微囊藻半固體平板培養(yǎng)，按照文獻(xiàn)［25］的方法進(jìn)行。

HGZ 培養(yǎng)基配方:NaNO3496 mg，KH2PO439 mg，MgSO4· 7H2O 75 mg，CaCl2· 2H2O 36 mg，Na2SiO3·9H2O 58 mg，土壤浸出液3 ml，PIV 金屬溶液3 ml (Na2-EDTA 75 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 9.7 mg，MnCl2·4H2O 4.1 mg，ZnCl20.5 mg，CoCl2·6H2O 0.2 mg，Na2MoO4· 2H2O 0.4 mg，蒸餾水100 ml)，蒸餾水994 ml，pH 8.0 ～8.5。

1.3 溶藻放線菌的篩選

初篩采用平板溶藻試驗(yàn)。將前期工作獲得純培養(yǎng)的放線菌菌種采用點(diǎn)接種方法，分別接種于YIM38 固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)3 ～5 d，無菌條件下用打孔器將各單菌落打下，并放置于藻平板上，培養(yǎng)3 d 后觀察溶藻圈的產(chǎn)生情況。用同樣大小的YIM38 培養(yǎng)基瓊脂塊作空白對照。

復(fù)篩采用液體溶藻試驗(yàn)。將初篩試驗(yàn)中活性較好的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，6 d 后終止發(fā)酵，并取2%(體積比)的發(fā)酵上清液加入藻液(藻細(xì)胞濃度為1 ml 1.0×107個)，培養(yǎng)3 d 后采用熱乙醇法［26］測定葉綠素a 的含量，根據(jù)葉綠素a 含量判斷溶藻效果。對照組藻液中加入2%(體積比)的無菌水。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:大豆粉15 g，葡萄糖15 g，酵母膏2 g，淀粉10 g，蛋白胨2 g，麥芽膏粉2 g，NaCl 4 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，定 容 至1 000 ml，pH 7.8 (定 容 測 pH 后，再將CaCO3加入培養(yǎng)基內(nèi))。

1.4 放線菌孢子和菌絲體的溶藻活性

取放線菌孢子懸液(濃度為1 ml 1.0×107個)1 ml 加入100 ml 藻液中(藻細(xì)胞濃度為1 ml 1.0×107個)，培養(yǎng)7 d 后檢測溶藻活性，對照組加入1 ml無菌水。將孢子接種于YIM38 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，無菌過濾培養(yǎng)液，并用無菌水洗滌濾得的菌絲體3 次，充分除去培養(yǎng)基和胞外產(chǎn)物，分別稱取質(zhì)量為0、0.5 g、1.0 g、1.5 g 和2.0 g 菌絲體加入100 ml 藻液，培養(yǎng)3 d 后檢測溶藻活性，對照組不加菌絲體。

1.5 不同發(fā)酵產(chǎn)物的溶藻活性

采用復(fù)篩培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后4 500 r/min 離心20 min，獲得菌體和發(fā)酵上清液。上清液在50 ℃條件下減壓蒸餾，剩余少量水時采用乙酸乙酯連續(xù)萃取3 次，合并萃取相，并減壓蒸餾除去其中的有機(jī)溶劑即得胞外產(chǎn)物脂溶性成分，除去萃余相中殘余的有機(jī)溶劑后真空冷凍干燥即得胞外產(chǎn)物水溶性成分。將菌絲體用無菌水洗滌3 次，濾干水后用丙酮浸泡，于-20 ℃下處理24 h，再于40 ℃水浴中超聲破壁30 min 后過濾，濾液50℃下減壓蒸餾除去丙酮，剩余少量水后按照上清液的處理方法處理，得到胞內(nèi)脂溶性物質(zhì)和水溶性物質(zhì)。取以上4 個組分分別加入100 ml 藻液中，樣品終濃度為100 μg/ml，培養(yǎng)3 d 后檢測溶藻活性。設(shè)2 個對照組，分別加2 ml 發(fā)酵上清液和2 ml 無菌水。

1.6 溶藻活性成分的穩(wěn)定性研究

取發(fā)酵上清液分別進(jìn)行以下處理:(1)水浴加熱處理2 h，處理溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃;(2)pH 值處理，將樣品pH 值用1 mol/L 的NaOH 和鹽酸溶液分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 和12.0，50 ℃水浴處理2 h 回調(diào)到原始pH 值，并用細(xì)菌濾器過濾;(3)將發(fā)酵上清液置于無菌培養(yǎng)皿中，在紫外線254 nm 處理2 h(樣品與光源距離15 cm)。取各處理樣品2 ml 加入100 ml 藻液(藻細(xì)胞濃度為1 ml 1.0×107個)，培養(yǎng)3 d 后檢測溶藻活性。對照組加2 ml 無菌水。

1.7 溶藻活性成分對銅綠微囊藻生長曲線的影響

在藻液(1 ml 4.0×106個)中加入1%(體積比)的發(fā)酵上清液，光照培養(yǎng)，每2 d 取樣1 次，并用血球計數(shù)板計數(shù)藻細(xì)胞數(shù)量，共培養(yǎng)40 d，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，藻細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制藻細(xì)胞生長曲線。對照組加1%(體積比)的無菌水。

1.8 溶藻放線菌JXJ-0110 的16S rDNA 序列分析［27］

采用酶解法提取基因組DNA，用細(xì)菌通用引物PA(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和PB(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系(總體積為50.0 μl，包含10×Buffer 5.0 μl、dNTP 4.0 μl、PA 1.0 μl、PB 1.0 μl、Taq酶0.3 μl，雙蒸水37.7 μl、DNA 模板1.0 μl)，循環(huán)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存24 h。PCR 反應(yīng)完畢后利用0.8%(質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增結(jié)果，送檢序列，并將其16S rDNA序列在GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比較，用MEGA4 軟件進(jìn)行Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 溶藻放線菌菌株的篩選

試驗(yàn)結(jié)果表明，放線菌JXJ-0110 具有較強(qiáng)的溶藻活性，直徑為5.0 mm 的菌落在藻平板上形成直徑達(dá)30.0 mm 的溶藻圈;在藻液中加入2%(體積比)的發(fā)酵上清液，3 d 后銅綠微囊藻藻液綠色消失，變成黃色，葉綠素a 含量為0.280 mg/L，僅為對照組的11.6%，溶藻效率達(dá)到88.4%。

2.2 放線菌孢子和菌絲體的溶藻活性

試驗(yàn)結(jié)果表明，放線菌JXJ-0110 孢子萌發(fā)時具有一定的溶藻活性，與對照組相比，葉綠素a 的去除率為8.5%，這可能是放線菌孢子萌發(fā)后與藻細(xì)胞競爭營養(yǎng)成分，并產(chǎn)生微量溶藻活性物質(zhì)，影響藻細(xì)胞生長，但由于藻培養(yǎng)基缺乏有機(jī)碳源，因此放線菌孢子萌發(fā)后難以迅速生長，短期內(nèi)不會對藻細(xì)胞生長造成大的影響。

放線菌JXJ-0110 的菌絲體具有較好的溶藻活性(圖1)，且呈劑量關(guān)系，在100 ml(1 ml 1.0×107個)藻液中加入鮮質(zhì)量為0.5 g 的菌絲體，3 d 后葉綠素a 的去除率為60.5%，當(dāng)菌絲體鮮質(zhì)量為2.0 g 時，去除率達(dá)91.2%(圖1)。菌絲體溶藻的原因可能包括以下幾點(diǎn):(1)菌絲體胞內(nèi)積累的中間代謝產(chǎn)物繼續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)槿茉寤钚晕镔|(zhì)，并釋放到胞外殺死藻細(xì)胞;(2)利用溶解死亡的藻細(xì)胞為碳源生長，和藻細(xì)胞競爭有限的氮營養(yǎng)元素，從而影響藻細(xì)胞生長;(3)菌絲體本身對藻細(xì)胞具有一定的絮凝作用，導(dǎo)致藻細(xì)胞成團(tuán)，從而影響藻細(xì)胞生長;(4)菌絲體自溶，釋放出胞內(nèi)溶藻活性物質(zhì)影響藻細(xì)胞生長。

2.3 不同發(fā)酵產(chǎn)物的溶藻活性

試驗(yàn)結(jié)果(圖2)表明，胞外產(chǎn)物水溶性成分和胞內(nèi)產(chǎn)物脂溶性成分均具有較好的溶藻活性，藻液中加入濃度為100 μg/ml 的樣品時，3 d 后葉綠素a的含量分別為0.228 mg/L 和0.336 mg/L，與對照組(2.411 mg/L)相比，葉綠素a 的去除率分別為90.5%和86.1%。

圖1 放線菌JXJ-0110 菌絲體的溶藻活性Fig.1 Alage-lysing activity of mycelia of strain JXJ-0110

圖2 放線菌JXJ-0110 不同代謝產(chǎn)物的溶藻活性Fig.2 Alage-lysing activities of different metabolites from strain JXJ-0110

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性

試驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，在供試所有溫度下，放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物均能極顯著影響藻液葉綠素a的含量(P＜0.01);隨著處理溫度的升高，放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物的溶藻活性呈下降趨勢，30 ℃時葉綠素a 的去除率為88.4%，而100 ℃時為64.7%。但溶藻活性總體上對溫度相對較穩(wěn)定，當(dāng)處理溫度在90 ℃以下時，葉綠素a 的去除率在82%以上，活性喪失約為7%左右。由于蛋白質(zhì)在高溫條件下很容易變性失活，因此，該菌產(chǎn)生的活性成分可能主要是小分子物質(zhì)。

試驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明，放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物在pH 3 ～11 時葉綠素a 的去除率均在71%以上，在pH 6 ～10 時，超過82%，其中pH 8 時去除率最高，超過88%(pH 未處理組為88.4%)。通過對各三角瓶中發(fā)酵原液的pH 值檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵原液的pH 值均在8 左右。隨著pH 值進(jìn)一步升高，溶藻活性明顯下降，當(dāng)pH 值從11 增加到12 時，葉綠素a 的去除率由71.6%下降到56.1%。

圖3 溫度處理對放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物溶藻活性的影響Fig.3 Alage-lysing activities of metabolites from strain JXJ-0110 treated at different temperatures

圖4 不同pH 值處理后JXJ-0110 代謝產(chǎn)物的溶藻活性Fig.4 Alage-lysing activities of metabolites from strain JXJ-0110 treated with different pH values

試驗(yàn)結(jié)果顯示，放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物經(jīng)紫外線254 nm 處理2 h 后，與對照組相比，葉綠素a的去除率為86.4%，這說明該菌產(chǎn)生的溶藻活性成分對紫外線具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物對銅綠微囊藻生長曲線的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物加入藻液后，藻細(xì)胞數(shù)量迅速下降，并一直維持在一個較低的水平(1 ml 0.21×107個左右)。而對照組藻細(xì)胞生長曲線具有單細(xì)胞微生物生長曲線的典型特征，即由延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期組成，1 ～8 d 為延滯期，藻細(xì)胞數(shù)量由1 ml 0.4×107個 增長到1 ml 1.0×107個;8 ～22 d 為對數(shù)期，藻細(xì)胞由1 ml 1.0×107個增長到10.3×107個;22 ～36 d 為穩(wěn)定期，藻細(xì)胞數(shù)量在1 ml 10×107～11×107個;36 d 后進(jìn)入衰亡期，藻細(xì)胞數(shù)量明顯下降。

圖5 放線菌JXJ-0110 代謝產(chǎn)物對銅綠微囊藻生長曲線的影響Fig.5 The influence of metabolites from strain JXJ-0110 on the growth of M.aeruginosa cells

2.6 放線菌JXJ-0110 的16S rDNA 基因序列分析

菌株JXJ-0110 的16S rDNA核苷酸序列全長為1 410 bp，在GenBank 數(shù)據(jù)庫中通過Blast 發(fā)現(xiàn)，該菌與Streptomyces shenzhenensis172115T相似性最高，達(dá)到99.06%。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中調(diào)集相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列，采用軟件Clustalx 進(jìn)行比對，通過MEGA4 以Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，發(fā)現(xiàn)，該菌株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與S.shenzhenensis、S.gramineusJR-43T(HM748598)和S.lanatusNBRC 12787T(AB184845)單獨(dú)聚在一支，JXJ-0110 與后兩者的相似性分別為97.78% 和97.76%。根據(jù)以上結(jié)果可以確定，該菌是鏈霉菌屬的成員，但是否是新種尚需其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

圖6 菌株JXJ-0110 及其相關(guān)屬種的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of JXJ-0110 and related taxa

3 討論

銅綠微囊藻是水華藍(lán)藻中危害最大的藻種之一，也是中國富營養(yǎng)化湖泊藍(lán)藻水華的主要藻種，如何有效防治銅綠微囊藻在藍(lán)藻水華治理中具有重要意義。

16S rRNA基因序列分析表明，菌株JXJ-0110 是鏈霉菌屬的成員，鏈霉菌是放線菌的優(yōu)勢類群，是代謝產(chǎn)物最豐富的微生物。目前報道的溶藻放線菌多數(shù)為鏈霉菌，諸如不產(chǎn)色鏈霉菌(S.achromogenes)［28］、生暗鏈霉菌(S.phaeofaciens)［9］、寢屋川鏈霉菌(S.neyagawaensis)［29］、灰霉素鏈霉菌(S.griseinus)［30］和脫葉鏈霉菌(S.exfoliatus)［31］等。

然而，Sigee 等［31］研究表明，室內(nèi)具有良好溶藻效果的菌株，在野外防治效果卻可能不甚理想，其原因包括:(1)水環(huán)境(水的理化性質(zhì)和其他生物等)對拮抗生物的生長速率、數(shù)量和拮抗活性等的影響;(2)藍(lán)藻在自然水體中對拮抗生物的反應(yīng)與實(shí)驗(yàn)室中可能不同;(3)這兩類生物在自然水體生態(tài)系統(tǒng)中的生態(tài)位不同等。這些原因?qū)е略孱惡娃卓股锏姆蛛x，從而影響其防治效果。因此，拮抗微生物在野外自然水體中要發(fā)揮良好的防治效果，就必須在水環(huán)境中具有一定的生物量，對水環(huán)境的理化性質(zhì)和其他生物具有一定的耐受性，并能夠處于表層水，和藻類充分接觸，從而發(fā)揮溶藻作用。

放線菌的孢子較輕，易于浮在水面，與藻類充分接觸，其萌發(fā)后的菌絲可產(chǎn)生溶藻活性成分，又可絮凝藻細(xì)胞并使之沉入水底，從而發(fā)揮防治效果。

放線菌JXJ-0110 的孢子加入藻液萌發(fā)后具有一定的溶藻活性，但由于藻培養(yǎng)基是組合培養(yǎng)基，其中不含有異養(yǎng)微生物可利用的有機(jī)碳源，這限制了孢子萌發(fā)后的進(jìn)一步生長和產(chǎn)生溶藻活性成分。自然環(huán)境水體中含有一定量的有機(jī)物，這些有機(jī)物可為萌發(fā)的孢子進(jìn)一步生長和產(chǎn)生溶藻活性成分提供碳源。因此，放線菌JXJ-0110 的孢子對野外水華藍(lán)藻可能具有更好的溶藻活性，值得進(jìn)一步研究。

放線菌JXJ-0110 的菌絲體具有很強(qiáng)的溶藻活性，除了菌絲體自身絮凝藻細(xì)胞和競爭藻細(xì)胞的氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)的作用外，更主要的原因可能是菌絲體在藻液中繼續(xù)產(chǎn)生胞外溶藻活性物質(zhì)而溶藻，死亡溶解的藻細(xì)胞又為菌絲體提供碳氮等營養(yǎng)物質(zhì)，使菌絲體進(jìn)一步生長和產(chǎn)生溶藻活性物質(zhì)，同時，那些自溶死亡的菌絲體還可釋放出胞內(nèi)脂溶性溶藻活性物質(zhì)而溶藻。

該菌產(chǎn)生的胞外溶藻活性成分是水溶性物質(zhì)，水溶性物質(zhì)在水中的分散性好，可在短時間內(nèi)與藻細(xì)胞充分接觸而將藻細(xì)胞迅速殺死。同時，這些活性成分在較高的溫度下穩(wěn)定性好，在較廣泛的pH值條件下不易失活，對紫外線也具有較好的穩(wěn)定性，試驗(yàn)條件下能夠較長時間抑制銅綠微囊藻的生長。以上這些結(jié)果說明，放線菌JXJ-0110 及其代謝產(chǎn)物在藍(lán)藻水華防治方面具有潛在的價值。

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