謝文剛，劉文獻(xiàn)，張建全，王彥榮

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

牧草，廣義上泛指可用于飼喂家畜的草類植物，包括草本、藤本、小灌木、半灌木和灌木等各類栽培或野生植物；狹義上僅指可供栽培的飼用草本植物，尤指豆科牧草和禾本科牧草［1］。牧草是農(nóng)業(yè)自然資源的重要組成部分，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要生產(chǎn)資料，也是發(fā)展草地畜牧業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的牧草新品種，充分發(fā)揮其在改良退化農(nóng)田、恢復(fù)草地功能、調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)、固碳減排、建立草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中不可替代的作用，是保障國(guó)家食物安全和生態(tài)安全的重要措施之一。

遺傳連鎖圖譜是指通過(guò)遺傳重組分析得到的基因或?qū)Ｒ坏亩鄳B(tài)性遺傳標(biāo)記在染色體上的線性排列順序 圖［2］。目前包括玉米（Zeamays）［3］、水稻（Oryzasativa）［4］、小麥（Triticumaestivum）［5］等主要農(nóng)作物均已構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并被廣泛應(yīng)用于數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位［6］、比較基因組［7-8］和分子標(biāo)記輔助育種［9-10］等領(lǐng)域以改良植物的重要農(nóng)藝性狀，大幅度提高植物的育種水平和育種效率。和大多數(shù)農(nóng)作物相似，牧草許多重要的農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等一般為數(shù)量性狀，受微效多基因控制。牧草常規(guī)育種周期長(zhǎng)，效率低，而利用DNA分子標(biāo)記構(gòu)建牧草遺傳圖譜，開(kāi)展QTL定位研究及分子標(biāo)記輔助育種，加快培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗牧草新品種已成為目前牧草育種工作中的一個(gè)重要發(fā)展方向。本文就牧草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及應(yīng)用的研究現(xiàn)狀和最新成果進(jìn)行了概述，以期為牧草分子育種的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

1 牧草遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究現(xiàn)狀

1.1 已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜

與多數(shù)一年生模式植物相比，牧草多為多年生、異交的多倍體植物，如紫花苜蓿、白三葉、鴨茅等同源四倍體，而羊草（Leymuschinensis）為異源四倍體，遺傳背景相對(duì)復(fù)雜，異交多倍體牧草存在分離基因型眾多、不同DNA片段共分離，雜交后代常表現(xiàn)為四體遺傳等特點(diǎn)，造成其在遺傳分析上存在較多困難。但隨著“擬測(cè)交”策略的應(yīng)用［11］及各種分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已構(gòu)建了20余個(gè)草種近40張遺傳連鎖圖譜（表1）。所構(gòu)圖譜主要涉及豆科的苜蓿屬（特別是紫花苜蓿）［12-18］、三葉草屬［19-21］、百脈根［22-23］，禾本科的羊茅屬［24-26］、黑麥草屬［27-34］和鴨茅屬［35-37］等常見(jiàn)草種。

1.2 作圖群體

構(gòu)圖群體親本的選擇是群體構(gòu)建成功及圖譜質(zhì)量高低的決定因素之一，最大限度地選擇親本間性狀差異與親和性的統(tǒng)一是親本選擇的基本原則［2］。常見(jiàn)的遺傳連鎖圖譜的群體有：臨時(shí)性群體如F2及其衍生的F3、F4家系和回交群體（BC）。永久性分離群體，如回交自交系群體（BIL）、重組自交系群體（RIL）、雙單倍體群體（DH）、近等基因系群體。對(duì)于親本基因型高度雜合的植物，也可采用“雙擬測(cè)交”（Double-pseudo-testcross）的方法建立F1分離群體［11］?！半p擬測(cè)交”是指兩個(gè)親本基因型均為雜合，互為測(cè)交群體，與測(cè)交試驗(yàn)一樣，后代基因型的分離比例為1∶1，但兩個(gè)親本都非純合隱性，所以稱為擬測(cè)交。由于大多數(shù)牧草具有多年生、異花授粉和自交不親和等特性，使培育純系較為困難，難以構(gòu)建BC1等群體，因此，目前大部分牧草分子連鎖圖譜大部分是利用“雙擬測(cè)交”F1作圖群體構(gòu)建的，如多年生黑麥草［28-30］、多花黑麥草［32-33］、草地羊茅［26］、鴨茅［35-37］和賴草［38］等。對(duì)于自交衰退不嚴(yán)重的異交草種，也可仿照一年生農(nóng)作物創(chuàng)建自交純系進(jìn)行雜交以獲得F2群體或BC1群體進(jìn)行遺傳作圖，如結(jié)縷草（Zopsiaspp.）［41］、紫花苜蓿［12，14，16］等。

另外，作圖群體的大小也是影響圖譜品質(zhì)的重要因素。一般而言，大的作圖群體包含更多的基因重組個(gè)體，在遺傳作圖時(shí)能獲得更多的分離標(biāo)記，使所構(gòu)圖譜更飽滿，基因組覆蓋更全面。如 Mott等［39］利用含387個(gè)后代的回交群體，構(gòu)建了含515個(gè)分子標(biāo)記，圖幅長(zhǎng)度為2 574cM的遺傳圖譜，標(biāo)記間的平均距離為4.9cM。

1.3 作圖標(biāo)記

DNA分子標(biāo)記直接反映植物分子水平上的遺傳多態(tài)性，因其簡(jiǎn)單、快捷、受環(huán)境影響小和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于牧草遺傳圖譜構(gòu)建研究中。目前，用于植物遺傳作圖的主要分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SRAP和SSR等。

對(duì)于大多數(shù)牧草物種而言，親本是高度雜合的個(gè)體，從親本到子代需要傳遞多個(gè)等位基因，RAPD等顯性標(biāo)記往往難以區(qū)分純合基因型或雜合基因型，而SSR等共顯性標(biāo)記能夠檢測(cè)多個(gè)等位位點(diǎn)，獲得異交親本中最大量的多態(tài)性。早期構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜主要利用的分子標(biāo)記是RFLP和AFLP等。RFLP標(biāo)記具有重復(fù)性好和共顯性的特點(diǎn)，在構(gòu)建牧草核心或框架圖譜，特別是比較作圖中有重要作用。如Xu等［24］利用RFLP標(biāo)記構(gòu)建了高羊茅的遺傳圖譜，構(gòu)圖群體中有105個(gè)子代，圖譜長(zhǎng)度達(dá)1 274cM，分布在19個(gè)連鎖群。該標(biāo)記也被用在紫花苜蓿［12-14，16］、多年生黑麥草［28，30，32］等草種的遺傳圖譜構(gòu)建上。AFLP技術(shù)耗時(shí)量小，信息量大，是構(gòu)建高精密度分子遺傳圖譜的重要標(biāo)記。如Sandal等［23］在日本百脈根的研究中利用AFLP所構(gòu)建的圖譜中圖幅的平均距離已小到0.6cM。SSR標(biāo)記由于具有共顯性、基因組中分布廣泛、重復(fù)性好、多態(tài)性高、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，避免了RFLP方法中使用放射性同位素的缺點(diǎn)，又比RAPD重復(fù)率和可信度高，在遺傳圖譜構(gòu)建方面具有廣闊的研究前景，是理想的標(biāo)記之一，已應(yīng)用于紫花苜蓿［17］、紅三葉［20］、高羊茅［25］、黑麥草［27，29］、鴨茅［35-37］、賴草［38］、結(jié)縷草［42，44］等草種的遺傳圖譜構(gòu)建。隨著高通量測(cè)序等技術(shù)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、序列標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequence tag Site，STS）標(biāo)記［39］及多樣性微陣列技術(shù)（Diversity Arrays Techenology，DArT）［31］等新型標(biāo)記也將在遺傳作圖中顯示出廣泛的應(yīng)用前景。

表1 牧草遺傳圖譜構(gòu)建研究進(jìn)展Table 1 Genetic linkage maps in forage grasses

續(xù)表1

2 牧草遺傳連鎖圖譜的應(yīng)用

對(duì)于牧草育種者而言，牧草大多數(shù)的性狀如干物質(zhì)產(chǎn)量、牧草品質(zhì)和非生物抗性等常表現(xiàn)出連續(xù)的表型變異，并受多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)控制。以往育種者主要是通過(guò)多年輪回選擇對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行改良，育種周期長(zhǎng)，效率低。分子遺傳連鎖圖譜則有助于在分子層面分析與主要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的基因區(qū)域或分子標(biāo)記，從而定位和克隆重要的農(nóng)藝性狀基因、檢測(cè)和標(biāo)記數(shù)量性狀位點(diǎn)，并應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種，可大幅度提高牧草育種的水平和效率。

2.1 牧草重要農(nóng)藝性狀QTL定位

隨著分子標(biāo)記技術(shù)和分子連鎖圖譜構(gòu)建的迅猛發(fā)展，使得數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位成為可能。目前國(guó)外已有大量的牧草QTL研究的報(bào)道（表2），主要集中在黑麥草屬［27，50-70］、賴草屬［73-77］和苜蓿屬［78-84］等。我國(guó)牧草QTL研究的報(bào)道相對(duì)較少，僅見(jiàn)于鴨茅［37］、高丹草［40］、結(jié)縷草［90］等少數(shù)草種。在牧草QTL研究領(lǐng)域，黑麥草屬Q(mào)TL研究最為廣泛和深入，研究?jī)?nèi)容涉及多個(gè)主要的農(nóng)藝性狀，如抗病性［50-56］、開(kāi)花期［60-63］、種子產(chǎn)量相關(guān)性狀［58］、牧草品質(zhì)相關(guān)性狀［64-65］、牧草產(chǎn)量相關(guān)性狀［67］等。

2.1.1 抗病QTL定位 牧草抗病QTL研究主要集中在黑麥草屬上，包括抗銹病、細(xì)菌性萎蔫病、霉粉病和葉斑病等。Studer等［27］用含307單株的“雙擬測(cè)交”群體為材料對(duì)多花黑麥草冠銹病QTL進(jìn)行了研究，在第1和2連鎖群上檢測(cè)到抗冠銹病相關(guān)QTL，它們能解釋高達(dá)56%的表型變異。在多年生黑麥草第1和2連鎖群上也發(fā)現(xiàn)了4個(gè)冠銹病QTLs，其中LpPc4和LpPc2位于第1連鎖群，Lp-Pc3和LpPc1位于第2個(gè)連鎖群上，它們分別能解釋12.5%、24.9%、5.5%和2.6%的表型變異，比較作圖分析發(fā)現(xiàn)，這些QTL所在連鎖群與燕麥A和B染色體具有同源性，在燕麥A和B染色體上已經(jīng)鑒定了抗冠銹病相關(guān)基因［52］。Pfender等［54］也在第1、6和7連鎖群上共檢測(cè)到3個(gè)抗桿銹病QTL（qLpPg1、qLpPg2、qLpPg3），其中主效 QTL（qLpPg1）定位在第7連鎖群上，可解釋30%～38%的表型變異。

2.1.2 產(chǎn)量相關(guān)QTL定位 提高牧草單位面積草產(chǎn)量或種子產(chǎn)量是牧草的主要育種目標(biāo)，其中種子產(chǎn)量對(duì)牧草品種的生產(chǎn)、推廣和應(yīng)用有重要影響。Espinoza等［84］利用蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）4個(gè)作圖群體研究了主枝長(zhǎng)度（LPB）、分枝延伸率（BER）、干物質(zhì)（ADM）、主莖干長(zhǎng)（LMS）等產(chǎn)量相關(guān)性狀，通過(guò)對(duì)單個(gè)和多個(gè)群體的分析表明，主要的QTL區(qū)域位于第1、2、7和8染色體上，多群體分析揭示了3個(gè)與LPB、LMS、BER等性狀密切相關(guān)的主效的QTL區(qū)域。Studer等［58］利用F2作圖群體，構(gòu)建了黑麥草遺傳連鎖圖譜，在連鎖群1和2上檢測(cè)到兩個(gè)與種子產(chǎn)量相關(guān)的QTL，它們分別解釋了41%和18%的表型變異。Faville等［67］在多年生黑麥草連鎖群1、2、4和6上檢測(cè)到與草產(chǎn)量有關(guān)的QTL。Herrmann等［86］檢測(cè)到38個(gè)與紅三葉種子產(chǎn)量性狀相關(guān)（每株植物的種子數(shù)、每個(gè)花序上的種子產(chǎn)量、每株植物上的花序數(shù)等）的QTL，這為紅三葉種子產(chǎn)量性狀的改良和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。Robins和Brammer［80］利用紫花苜蓿F1群體對(duì)影響牧草產(chǎn)量、株高、再生性等產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行了QTL分析，分別在連鎖群3、4、5和7上檢測(cè)到影響這些性狀的QTL位點(diǎn)，它們解釋的表型變異在11%～44%。

表2 牧草主要農(nóng)藝性狀QTLTable 2 QTL for important agronomic trait in forage grasses

2.1.3 牧草品質(zhì)相關(guān)QTL定位 Espinoza和Julier［83］利用蒺藜苜蓿作圖群體研究了粗蛋白、消化率等品質(zhì)相關(guān)的QTL，主效QTL主要分布于染色體1、3、7和8的4個(gè)基因區(qū)域，其中牧草品質(zhì)相關(guān)的QTL和形態(tài)QTL定位在相同的區(qū)域，由此推測(cè)品質(zhì)性狀和表型特征具有緊密的關(guān)系，該研究為進(jìn)一步鑒定和挖掘豆科牧草品質(zhì)相關(guān)的基因奠定了基礎(chǔ)。Cogan等［64］對(duì)黑麥草牧草品質(zhì)（如粗蛋白、體外消化率、中性洗滌纖維等）的QTL進(jìn)行了分析，在連鎖群3、5、7上共檢測(cè)到42個(gè)影響這些性狀的QTL位點(diǎn)，其中LG3包含了影響所觀測(cè)性狀的所有QTL位點(diǎn)，LG7上包含了除粗蛋白外的所有QTL位點(diǎn)。研究指出，與這些位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)于分子標(biāo)記輔助育種有重要利用價(jià)值。碳水化合物含量（WSC）是決定牧草品質(zhì)的一個(gè)重要因素，對(duì)該性狀進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)于黑麥草分子育種及目標(biāo)性狀的改良意義重大。Turner等［65］檢測(cè)到影響黑麥草 WSC含量的QTL，同時(shí)利用與WSC含量QTL緊密連鎖的標(biāo)記去測(cè)試這些QTL的效應(yīng)，雖然WSC含量和其他因素有復(fù)雜的相互影響，但進(jìn)一步證明了這些QTL區(qū)域?qū)邴湶軼SC含量有調(diào)控作用。另外，黑麥草脂肪酸成分QTL也被定位于相應(yīng)的連鎖群上，其中棕櫚酸含量（C16：0）QTL位于連鎖群2和7、硬脂酸（C18：3n-3）位于連鎖群3、4和7、亞油酸（C18：2n-6）和亞麻酸（C18：3n-3）分別位于連鎖群2和1［69］。Larson和 Mayland［73］對(duì)賴草粗蛋白（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和 Al、B、Ca、Cu等14種礦物質(zhì)含量及 K／（Ca＋Mg）比例（KRAT）等進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在作圖群體中這些性狀存在顯著的變異，并檢測(cè)到所有性狀的QTL位點(diǎn)，如 ADF位于 LG1a、LG5Xm、LG7a、NDF位于LG7a，Mn位于 LG2b、LG3b、LG4Xm，S位于 LG3等。研究結(jié)果對(duì)于篩選和培育新的賴草新品種，鑒定和挖掘影響礦物質(zhì)含量及纖維互作的功能基因也有重要意義。

2.1.4 抗非生物脅迫QTL定位 水澇通過(guò)影響植物根部對(duì)水分的吸收從而影響植物正常生長(zhǎng)。Pearson等［68］利用NAx和AU6為親本構(gòu)建了F1作圖群體，在對(duì)作圖群體進(jìn)行8d水澇脅迫后，測(cè)定了9個(gè)相關(guān)的數(shù)量性狀，最終檢測(cè)到37個(gè)QTL位點(diǎn)。其中19個(gè)QTL位點(diǎn)位于NAx圖譜上，18個(gè)位于AU6圖譜上。在連鎖群3和4上發(fā)現(xiàn)了黑麥草耐澇相關(guān)的特殊區(qū)域。在抗凍性和抗旱性研究方面，Alm等［71］在草地羊茅染色體5F上檢測(cè)到兩個(gè)抗凍性QTL，在染色體3F上檢測(cè)到1個(gè)抗旱性QTL。Brouwer等［79］利用紫花苜蓿為材料定位了冬季抗寒、抗凍和秋季生長(zhǎng)性QTL，在第5和8連鎖群上發(fā)現(xiàn)了影響秋季生長(zhǎng)，冬季抗寒、抗凍的QTL，但僅對(duì)秋季生長(zhǎng)和抗凍性有影響的QTL定位在連鎖群1和3，這些QTL區(qū)域可用于分子標(biāo)記輔助育種選擇。Sledge等［81］對(duì)二倍體紫花苜蓿抗鋁性進(jìn)行了QTL研究，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)RFLP標(biāo)記UGAc471和UGAc502與作圖F2群體的抗鋁性緊密連鎖，可用于將檢測(cè)到的QTL位點(diǎn)滲入到栽培的紫花苜蓿品種以提高其抗鋁性。丁成龍等［90］在人工低溫脅迫條件下研究結(jié)縷草葉片的半致死溫度（LT50）、可溶性糖、可溶性蛋白含量及過(guò)氧化物歧化酶（SOD）活性的變化，并以447個(gè)SSR標(biāo)記構(gòu)建的日本結(jié)縷草遺傳連鎖圖譜為基礎(chǔ)，對(duì)抗寒相關(guān)的性狀可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性進(jìn)行了QTL定位分析，分別定位到與葉片可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD活性相關(guān)的QTL各1個(gè)，分布于連鎖群10、13和17。

2.1.5 繁殖性狀相關(guān)QTL 了解植物的繁殖特性與種子生產(chǎn)性能是種質(zhì)資源的保存與更新、野生種的馴化選育和新品種推廣利用的重要前提。深入研究草類植物繁殖性狀的生物學(xué)基礎(chǔ)，培育種子產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能好的草類新品種，是以往國(guó)內(nèi)外關(guān)注不多、但目前亟待研究的重要領(lǐng)域。草類植物的繁殖性狀，主要包括開(kāi)花時(shí)間、花部形態(tài)、種子育性、種子落粒性、種子形態(tài)等。Xie等［37］在鴨茅連鎖群2、5和6檢測(cè)到與開(kāi)花時(shí)間相關(guān)的7個(gè)QTL。其中LG2上的QTL定位在兩親本同源連鎖群相同區(qū)域，且都與標(biāo)記Contig3046緊密連鎖，QTL分別解釋了8%和22%的表型變異。該研究所定位的QTL位置與近緣物種如黑麥草等所定位的開(kāi)花QTL位置基本一致，為近一步挖掘鴨茅開(kāi)花基因奠定了良好基礎(chǔ)。Larson和Kellogg［74］在賴草屬雜交種第6條染色體檢測(cè)到控制落粒性的QTL，該位點(diǎn)與水稻第2條染色體具有同源性。Ergon等［72］在草地羊茅染色體7F上檢測(cè)到一個(gè)影響小穗數(shù)量變異的基因區(qū)域。一個(gè)穗長(zhǎng)QTL、3個(gè)小穗數(shù)QTL被鑒定，分別解釋了32%～33%的表型變異。并且這些QTL與抽穗期QTL基本一致，表明他們受潛在的相關(guān)基因協(xié)作調(diào)節(jié)。在連鎖群4的頂端發(fā)現(xiàn)一個(gè)區(qū)域同時(shí)包含了抽穗時(shí)間、穗長(zhǎng)和小穗數(shù)QTL，同時(shí)這也是穗長(zhǎng)主效QTL所在位置。

2.2 重要農(nóng)藝性狀基因定位

從目前牧草研究情況看，在黑麥草、羊茅等少數(shù)牧草上有開(kāi)花基因和抗逆基因的相關(guān)報(bào)道。開(kāi)花期是牧草的重要農(nóng)藝性狀，對(duì)牧草產(chǎn)量、飼用品質(zhì)及利用價(jià)值有重要影響。抽穗開(kāi)花后飼草品質(zhì)往往快速下降，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)不同需要培育不同生育期的早晚熟品種，尤其在混播草地中培育晚熟的牧草品種能大大提高草地生產(chǎn)能力和利用效率。Jensen等［63］利用多年生黑麥草品種“Veyo”和來(lái)自于“Falster”的一個(gè)基因型雜交，構(gòu)建了含184個(gè)單株的F2的作圖群體，檢測(cè)到5個(gè)影響黑麥草春化的QTL，并在第4連鎖群上主效QTL的附近成功定位了一個(gè)春花基因VRN1。Xie等［92］利用水稻、小麥、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、黑麥草等物種的開(kāi)花期基因的保守序列，設(shè)計(jì)基因探針，與鴨茅基因組雜交進(jìn)行目標(biāo)基因的捕獲，通過(guò)測(cè)序并設(shè)計(jì)基因引物最終將Vrn3基因成功定位在鴨茅的第3個(gè)連鎖群上。Armstead等［60］在多年生黑麥草上鑒定了與水稻Hd1基因和大麥（Hordeumvulgare）HvCOl基因同源的抽穗基因LpHd1，該基因位于黑麥草第7染色體的定位區(qū)域。Tamura和Yamada［93］定位了多年生黑麥草的CBF基因簇，4個(gè)CBF基因（LpCBFIb，LpCBFII，LpCBFIIIb和LpCBIIIc）定位在連鎖群5上，另一個(gè)基因LpCBFVb定位于連鎖群1上。

2.3 比較基因組分析

比較作圖就是利用共同的遺傳標(biāo)記（主要是分子標(biāo)記、基因的cDNA克隆以及基因組克?。?duì)相關(guān)物種進(jìn)行物理或遺傳作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組的分布情況，揭示染色體片段上的同線性（Synteny）或共線性（Collinearity），從而對(duì)不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進(jìn)化歷程進(jìn)行準(zhǔn)確分析［94］。比較作圖的分子基礎(chǔ)是物種間DNA序列尤其是編碼序列的保守性。植物的比較作圖最早是在番茄（Lycopersiconesculentum）和馬鈴薯（Solanum tuberosum）［95］、番茄和胡椒（Pipernigrum）［96］之間進(jìn)行的。近年來(lái)，比較作圖在禾本科作物分子作圖上迅速發(fā)展。通過(guò)黑麥（Secalecereale）、玉米、小麥和水稻［97］、玉米和高粱（Sorghumbicolor）等［98］的比較基因組研究表明，雖然這些物種在遺傳背景、染色體組成、基因組大小存在差異，但比較作圖結(jié)果表明：許多標(biāo)記在不同作物的遺傳圖譜上的位置和順序都具有高度的保守性，說(shuō)明染色體間共線性片段和基因組的同源性在不同物種間廣泛存在。開(kāi)展牧草與作物間的比較基因作圖研究，對(duì)于在基因組研究較少的牧草物種中發(fā)現(xiàn)重要的農(nóng)藝性狀基因，開(kāi)展功能分析具有重要意義。

比較基因作圖和微線性分析表明，黑麥草抽穗基因LpHd1和草地羊茅抽穗基因FpHd1是水稻Hd1基因的同源基因。表明LpHd1和FpHd1基因預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列是類似CONSTANS基因鋅指蛋白，它們與水稻Hd1的序列同源性分別為61%～62%，而與大麥HvCOl的序列同源性為72%。同時(shí)LpHd1基因在黑麥草第7染色體的定位區(qū)域，與水稻Hd1基因所在的第6染色體和大麥HvCOl基因所在的第7H染色體的基因組間具有一定的共線性［60］。此外，多花黑麥草抽穗期的主效QTL與水稻抽穗期基因Hd3位點(diǎn)具有共線性關(guān)系［62］。而黑麥草上已發(fā)現(xiàn)3個(gè)與春化反應(yīng)相關(guān)的候選基因，DNA序列比對(duì)表明它們與二倍體小麥的TmVRN2基因及水稻的Hd1基因具有高度的同源性［99］。Alm等［71］對(duì)草地羊茅抗凍性和抗旱性 QTL進(jìn)行了定位，通過(guò)將草地羊茅兩個(gè)抗凍QTL小麥相關(guān)QTL進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，羊茅染色體5F上的兩個(gè)抗凍QTL與小麥同源連鎖群5A上的Fr-A1和Fr-A2具有較高同源性，草地羊茅3F上的抗旱性QTL與水稻染色體上相應(yīng)的抗旱位點(diǎn)具有線性關(guān)系。對(duì)鴨茅EST序列和黑麥草EST序列的同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)：鴨茅連鎖圖譜上的8個(gè)SSR標(biāo)記與黑麥草連鎖圖譜上的標(biāo)記具有同源性。其中，鴨茅連鎖群1、2、3、4的部分SSR標(biāo)記與黑麥草相同連鎖群上的標(biāo)記序列具有同源性。而鴨茅連鎖群5的SSR標(biāo)記與黑麥草第7連鎖群的EST序列具有同源性［37］。

3 牧草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建存在問(wèn)題及展望

遺傳圖譜的構(gòu)建開(kāi)創(chuàng)了牧草分子遺傳育種的新局面，但現(xiàn)階段直接用于牧草的育種實(shí)踐還有很大的距離。主要表現(xiàn)在以下方面：

（1）作圖標(biāo)記以隨機(jī)標(biāo)記為主，共顯性標(biāo)記利用有限。目前，一半以上牧草連鎖圖譜是用RAPD和AFLP等顯性標(biāo)記構(gòu)建而成的。雖然利用這些隨機(jī)標(biāo)記可獲得大量分離位點(diǎn)，快速構(gòu)建連鎖圖譜，但它們無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分純合子和雜合子，且這些標(biāo)記擴(kuò)增的片段通常是非編碼區(qū)域，難以直接用于分離控制重要農(nóng)藝性狀的基因，造成在牧草分子育種及目標(biāo)性狀改良上有很大的局限性，極大地降低了遺傳圖譜的應(yīng)用價(jià)值。因此，在遺傳標(biāo)記選擇上，應(yīng)多選用SSR、EST-SSR等共顯性標(biāo)記，同時(shí)利用近緣物種上成功構(gòu)圖且與重要農(nóng)藝性狀基因或QTL連鎖的標(biāo)記聯(lián)合作圖，以大大提高圖譜的飽和度，同時(shí)利于更準(zhǔn)確地進(jìn)行QTL分析及開(kāi)展不同物種間比較作圖分析。

（2）牧草遺傳圖譜構(gòu)圖群體選擇和群體大小。為保證連鎖圖譜的準(zhǔn)確性，每個(gè)群體應(yīng)保證有足夠的個(gè)體，而構(gòu)建骨架連鎖圖可基于大群體中的一個(gè)隨機(jī)小群體（如150個(gè)單株或家系）［100］。在已構(gòu)建的牧草連鎖圖譜中構(gòu)圖群體大小從幾十到幾百不等，僅有紅三葉［19］、日本百脈根［23］、多年生黑麥草［30］、鴨茅［37］、賴草［38］和冰草［39］等草種的部分作圖群體大于150個(gè)單株。但幾乎所有的構(gòu)圖群體是F1、F2暫時(shí)性分離群體，雖然這些群體構(gòu)建時(shí)間短、成本低、信息量大，但難以較長(zhǎng)期保存，研究結(jié)果的可比性不強(qiáng)，不利于信息的共享。在今后的工作中應(yīng)加強(qiáng)多子代永久群體的構(gòu)建和保存研究，發(fā)展基于更大的作圖群體下建立起來(lái)的植物遺傳連鎖圖譜。

（3）構(gòu)建的牧草連鎖圖譜大多密度偏低，且均勻性較差，難以滿足基因定位、克隆和分子輔助選擇育種的要求。已構(gòu)建的牧草連鎖圖譜大多是框架圖譜，連鎖群數(shù)與研究對(duì)象實(shí)際染色體數(shù)或多或少存在差異，不同構(gòu)圖群體和不同親本間的連鎖群有時(shí)也不同；大多數(shù)已構(gòu)建的牧草圖譜的圖幅較小，標(biāo)記間的間隙較大，還不能滿足QTL分析、基因克隆和分子標(biāo)記輔助選擇對(duì)遺傳圖譜的要求。加強(qiáng)準(zhǔn)確、完整、實(shí)用和高密度遺傳圖譜的構(gòu)建研究十分必要。

總之，植物遺傳連鎖圖譜的發(fā)展趨勢(shì)是高飽和化、實(shí)用化和通用化。隨著人們對(duì)牧草重要性認(rèn)識(shí)的不斷提高及分子生物學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，牧草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的研究必將邁上一個(gè)新的臺(tái)階。在此基礎(chǔ)上結(jié)合牧草育種的主要目標(biāo)開(kāi)展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等重要農(nóng)藝性狀QTL定位研究，挖掘和克隆一批重要的功能基因，以改良牧草重要的農(nóng)藝性狀，加快牧草育種進(jìn)程，是牧草育種的必由之路。

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