郭慧琴，任衛(wèi)波，李 平，武自念，萬東莉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010）

羊草（Leymuschinesis），又名堿草，是禾本科賴草屬多年生根莖型禾草，廣泛分布于我國東北西部和內(nèi)蒙古中東部地區(qū)，是草甸草原和典型草原的優(yōu)勢種之一。羊草不僅具有營養(yǎng)價值高、適口性好、產(chǎn)草量高等優(yōu)點，還具有耐寒、耐鹽堿等特性，具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值［1］。然而，羊草有性繁殖能力低，種子休眠嚴(yán)重，發(fā)芽率低，當(dāng)年采集的種子發(fā)芽率僅為6%～10%［2-3］，這一“三低”問題嚴(yán)重影響了羊草栽培草地的建設(shè)和退化草原的補播恢復(fù)。因此，如何打破羊草種子休眠，提高羊草種子發(fā)芽率一度成為羊草研究的熱點之一。

圍繞羊草種子休眠機制及打破休眠的途徑和方法，國內(nèi)外已開展了大量的研究。目前認(rèn)為，導(dǎo)致羊草種子休眠、發(fā)芽率低的主要原因是羊草種子的稃片和胚乳中存在ABA等抑制物［4］。打破羊草種子休眠的方法主要包括去除稃片、變溫處理、聚乙二醇處理、外源激素調(diào)控等方面［2］。去除內(nèi)外稃后，羊草種子發(fā)芽率可由6%提高到45%；清水浸種1d，羊草種子發(fā)芽率可提高到36%，NaOH和水復(fù)合處理后，發(fā)芽率可達84%［2］。除此之外，外源激素調(diào)控是打破羊草種子休眠，提高發(fā)芽率的有效途徑，如，赤霉素、GA3、IAA、氟啶酮（FL）等激素對羊草種子發(fā)芽和種苗生長有促進作用［5-8］。

油菜素內(nèi)酯（BRs）是繼生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯以后的第六大類植物激素，廣泛分布于植物的根、莖、葉、花器和種子中，參與植物種子萌發(fā)、株型生長與發(fā)育、衰老、干旱、寒冷等逆境響應(yīng)等重要過程［9］。已有的研究表明，無論是在逆境脅迫下還是在正常環(huán)境下，油菜素內(nèi)酯都能夠顯著促進植物種子萌發(fā)［10-11］。因此，油菜素內(nèi)酯在打破羊草種子休眠，提高種子發(fā)芽能力等方面具有一定的潛力。然而，目前有關(guān)油菜素內(nèi)酯對羊草種子發(fā)芽率及幼苗生長影響的研究較少。那么油菜素內(nèi)酯到底對羊草種子萌發(fā)及種苗生長有什么影響？不同濃度間是否存在顯著差異？油菜素內(nèi)酯與赤霉素之間是否存在互作效應(yīng)？回答這些問題，將有望為解決羊草的“三低”問題提供新的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試野生羊草種子于2012年9月采自內(nèi)蒙古錫林浩特市毛登牧場。采集后的種子在室溫下晾干清選后，裝入布袋，放在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)計

激素處理試驗采用雙因素設(shè)計，其中雙因素為赤霉素GA3和2，4-表油菜素內(nèi)酯（EBR）兩種激素，每種激素設(shè)4個水平，其中GA3為0、200、300、500 μg·g-14個水平；2，4-表油菜素內(nèi)酯為0、0.01、0.10、1.00μg·g-14個水平，兩激素組合共16個處理（表1），每處理設(shè)4次重復(fù)，每個重復(fù)選用50粒羊草種子。

1.3 種子激素處理

根據(jù)試驗設(shè)計濃度（表1）配置激素溶液。精選飽滿的羊草種子，浸泡在相應(yīng)的激素溶液中，室溫下處理48h后，將種子撈出，并用蒸餾水沖洗3～5次，用0.1%NaClO消毒10min，再用蒸餾水沖洗2～3次，將種子置于培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽。（P＜0.05）。與對照相比，GA3處理后羊草種子發(fā)芽率增加3～4倍，處理與對照間差異顯著（P＜0.05）（圖1）。隨著GA3濃度的升高，羊草種子萌發(fā)率呈先上升后下降的趨勢，其中以300μg·g-1GA3處理種子萌發(fā)率最高，可達44%（圖1）。

表1 赤霉素與2，4-表油菜素內(nèi)酯濃度組合Table 1 Combination of different concentrations of gibberellin and brassnoids

油菜素內(nèi)酯與赤霉素在促進羊草種子萌發(fā)方面有顯著的互作效應(yīng)（P＜0.00）（表2）。不同濃度組合間存在顯著差異，其中以2，4-表油菜素內(nèi)酯0.10 μg·g-1＋GA3200μg·g-1組合最佳，處理后羊草種子萌發(fā)率可達76%（圖1），比單一2，4-表油菜素

1.4 種子發(fā)芽

將浸種過的種子，放入預(yù)先備好的培養(yǎng)皿中（蒸餾水充分潤濕、裝有雙層濾紙的直徑為12cm的培養(yǎng)皿）進行發(fā)芽試驗。培養(yǎng)條件為：16℃（16h）／28℃（8h），光照時間8h。每天稱重補水，并統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)，萌發(fā)周期為16d［3］。種子突破種皮即視為萌發(fā)。每處理隨機選取20株羊草幼苗，用測量紙測量其苗長和根長。

萌發(fā)率＝發(fā)芽結(jié)束后發(fā)芽種子數(shù)／供試種子總粒數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 14.0對所獲取數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果。對2，4-表油菜素內(nèi)酯、GA3及其互作對羊草種子萌發(fā)及種苗生長的影響進行二因素方差分析，并用Duncan法進行多重比較；采用Excel 2003制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2，4-表油菜素內(nèi)酯與赤霉素處理對羊草種子（EBR）發(fā)芽的影響

圖1 2，4-表油菜素內(nèi)酯與赤霉素復(fù)合處理對羊草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Interaction effect of EBR and GA3on the germination of Leymus chinesis

表2 不同激素與濃度互作對羊草種子萌發(fā)影響的方差分析Table 2 Two way ANVOA for the interaction effect of hormones and different concentration on germination

2，4-表油菜素內(nèi)酯對羊草種子萌發(fā)率有顯著影響（P＜0.05）。與對照相比，2，4-表油菜素內(nèi)酯處理后，羊草種子萌發(fā)率增加了2～4倍，差異顯著（P＜0.05）（圖1）。隨著濃度的升高，羊草種子萌發(fā)率呈先上升后下降的趨勢，其中以0.1μg·g-12，4-表油菜素內(nèi)酯處理后種子萌發(fā)率最高，可達54%（圖1）。GA3對羊草種子萌發(fā)率也有顯著影響內(nèi)酯處理增加21%，比單一GA3處理增加32%。其次為2，4-表油菜素內(nèi)酯0.01μg·g-1＋ GA3200μg·g-1，比上述最佳組合略低6%，兩者間差異不顯著（P＞0.05）（圖1）。

2.2 2，4-表油菜素內(nèi)酯與赤霉素處理對羊草幼苗生長的影響

2，4-表油菜素內(nèi)酯能同時促進羊草幼苗根和苗的生長。與對照相比，2，4-表油菜素內(nèi)酯處理后羊草幼苗苗長增加了11%～24%，根長增加了35%～40%，且對根長的影響差異均達到顯著水平（P＜0.05）（圖2、3）。隨著2，4-表油菜素內(nèi)酯濃度的升高，羊草幼苗的根長、苗長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但未達到顯著水平。

圖2 2，4-表油菜素內(nèi)酯與赤霉素復(fù)合處理對羊草種苗苗長的影響Fig.2 Interaction effect of EBR and GA3on the seedling growth of L .chinesis

圖3 2，4-表油菜素內(nèi)酯與赤霉素復(fù)合處理對羊草種苗根長的影響Fig.3 Interaction effect of EBR and GA3on the root length of L .chinesis

GA3能夠促進羊草幼苗生長，但對根生長有一定抑制作用。與對照相比，GA3處理后苗長增加了87%～101%，差異顯著（P＜0.05）（圖2）。隨著GA3濃度的升高，苗長呈先上升后下降的趨勢，其中以300μg·g-1GA3處理的苗長最長；而根長呈顯著下降趨勢，降低了15%～35%，且以500 μg·g-1GA3處理根長最短（P＜0.05）（圖3）。

油菜素內(nèi)酯與赤霉素組合在促進羊草種苗生長方面有顯著的互作效應(yīng)（P＜0.05）（表3），不同濃度組合間存在差異。對于苗長，以2，4-表油菜素內(nèi)酯0.01μg·g-1＋ GA3300μg·g-1組合最佳（圖2）；其次為2，4-表油菜素內(nèi)酯0.01μg·g-1＋GA3200 μg·g-1和2，4-表油菜素內(nèi)酯0.1μg·g-1＋GA3300μg·g-1組合，均比最佳組合處理低7.61%（P＞0.05）；再 次 為 2，4-表 油 菜 素 內(nèi) 酯 0.1 μg·g-1＋GA3200μg·g-1組合，比最佳組合降低了11.42%（P＜0.05）。

對于根長，以2，4-表油菜素內(nèi)酯0.01μg·g-1＋GA3200μg·g-1組合最佳（圖3），該組合處理后根長僅比單一2，4-表油菜素內(nèi)酯最佳濃度處理略低6.49%（P＜0.05）；其次為2，4-表油菜素內(nèi)酯0.10 μg·g-1＋GA3200μg·g-1組合（圖3），比最佳組合低3.87%，兩者間差異也未達到顯著水平（P＞0.05）。

3 討論

3.1 油菜素內(nèi)酯對植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

作為六大植物激素之一，油菜素內(nèi)酯對植物種子萌發(fā)及幼苗生長有重要的調(diào)控作用。適宜濃度的外源油菜素內(nèi)酯如2，4-表油菜素內(nèi)酯處理可促進植物種子萌發(fā)和幼苗生長，尤其是干旱和鹽脅迫等逆境條件下，效果更加明顯。如，0.05μg·g-12，4-表油菜素內(nèi)酯處理后，茄子（Solanummelongema）在150mol·L-1NaCl鹽脅迫下的種子發(fā)芽率提高8%，幼苗株高和根長分別增加了56.67%和23.83%［11］。經(jīng)2，4-表油菜素內(nèi)酯和硝普鈉復(fù)合處理后，玉米（Zeamays）種子的發(fā)芽率可提高15%～16%，主根長和芽長也有增加［12］。油菜素內(nèi)酯對黃豆（Glycinemax）種子萌發(fā)及下胚軸生長也有顯著的促進作用，0.05μg·g-1油菜素內(nèi)酯處理后，黃豆種子發(fā)芽率可提高14%～19%，下胚軸長度增加79%［13］。李凱榮和韓剛［14］也發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)酯對檸條（Caraganakorshinskii）和紫穗槐（Amorpha fruticosa）種子萌發(fā)及下胚軸生長有顯著影響，且隨著濃度的增加，種子發(fā)芽率呈先升高后降低的趨勢，其中以0.05μg·g-1油菜素內(nèi)酯處理效果最佳，與對照相比，種子發(fā)芽率可提高20%～23%。另外，外源BR可有效緩解擬南芥（Arabidopsisthaliana）GA3和ABA突變體的低發(fā)芽率問題［15］。在擬南芥中，過量表達dwf4基因（BR合成關(guān)鍵基因之一），能夠有效解除因ABA引起的種子休眠、恢復(fù)和提高擬南芥種子的發(fā)芽率［16］。過量表達HSD1基因（該基因參與BR的生物合成）后可有效降低擬南芥種子休眠［17］。本研究也發(fā)現(xiàn)，2，4-表油菜素內(nèi)酯對羊草種子萌發(fā)有顯著影響，適宜濃度下羊草種子萌發(fā)率顯著提高，這與其他植物已有的研究結(jié)果是一致的。BR對種子發(fā)芽的促進作用可能是通過乙醇胺磷酸甘油酯（Phosphatidylethanolamine）結(jié)合蛋白（MFT）調(diào)控來實現(xiàn)的［18］。

表3 不同激素與濃度互作對羊草種苗生長影響的方差分析Table 3 Two way ANVOA for the interaction effect of hormones and different concentrations on seedling growths

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的2，4-表油菜素內(nèi)酯能夠顯著促進羊草幼苗根的伸長，這與已有的研究結(jié)果一致。如，低濃度BR能夠同時提高擬南芥野生型和BR缺失突變體幼苗的根長［19］，在玉米野生型上也有類似的效果［20］，而且BR引發(fā)的根伸長作用途徑可能是與生長素調(diào)控途徑不同的獨立途徑，因為這種促進效應(yīng)不受生長素轉(zhuǎn)運抑制因子的影響［20］。

3.2 赤霉素對羊草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素對羊草種子萌發(fā)率及種苗生長有顯著影響，而且隨著赤霉素濃度的增加，種子發(fā)芽率、苗長呈先升高后降低的趨勢，但根長受到不同程度的抑制。這一結(jié)果與多數(shù)已有的研究結(jié)果是一致的。不同赤霉素濃度下羊草種子萌發(fā)率呈先增加后降低的單峰曲線變化，當(dāng)赤霉素濃度為300 μg·g-1時，羊草種子萌發(fā)率比對照提高9%，濃度超過400μg·g-1時，羊草種子萌發(fā)率顯著降低［6］。這說明低濃度的赤霉素可促進羊草種子萌發(fā)，但高濃度則對羊草種子萌發(fā)有明顯的抑制作用。300 μg·g-1赤霉素處理后，羊草的苗長顯著高于對照，根長和根冠比則呈逐步減少［6］。100～300μg·g-1GA3處理對羊草種子發(fā)芽表現(xiàn)為促進作用，當(dāng)GA3濃度超過400μg·g-1時，對羊草種子萌發(fā)率表現(xiàn)出不同程度的抑制［8］。與此同時，GA3處理顯著促進羊草幼苗伸長，但對根有一定的抑制作用，根冠比降低［8］。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度赤霉素處理對羊草種子發(fā)芽率無顯著影響［2］。造成差異的原因可能在于：1）處理方法的不同。得到顯著性差異結(jié)果的研究多是采用浸泡法即在發(fā)芽前將羊草種子完全浸泡在激素溶液中；而非顯著性的研究則是在種子發(fā)芽過程中，將赤霉素溶液添加進培養(yǎng)皿中，羊草種子未能與激素溶液充分接觸，這可能是導(dǎo)致處理效果截然不同的原因之一。采用添加法對羊草種子進行赤霉素處理后，也發(fā)現(xiàn)赤霉素對羊草種子萌發(fā)無顯著影響［4］。最近的研究為這一推測提供了進一步的證據(jù)。閆小紅等［21］研究發(fā)現(xiàn)，2，4-表油菜素內(nèi)酯浸泡處理辣椒（Capsicumannuum）種子后，其種子的發(fā)芽率顯著提高，但同樣濃度的2，4-表油菜素內(nèi)酯采用添加處理后，辣椒種子發(fā)芽率與對照相比無顯著變化。2）羊草種子來源不同。不同生態(tài)環(huán)境導(dǎo)致了羊草種子的品質(zhì)和發(fā)芽率存在顯著差異。已有的研究表明，不同來源的羊草種子經(jīng)過相同的處理后，種子發(fā)芽率表現(xiàn)出一定差異。同樣在300 μg·g-1赤霉素處理下，吉林長嶺地區(qū)采集的野生羊草種子發(fā)芽率為16.7%，黑龍江安達草原采集的野生羊草發(fā)芽率可達34.45%［8］。

3.3 2，4-表油菜素內(nèi)酯與GA3組合對植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

已有的研究表明，2，4-表油菜素內(nèi)酯是種子萌發(fā)過程中GA3生物學(xué)功能的促進因子，兩者在促進植物種子萌發(fā)和幼苗生長方面具有顯著的互作效應(yīng)。如，2，4-表油菜素內(nèi)酯與 GA3在促進綠豆（Vignaradiata）上胚軸和黃瓜（Cucumissativus）下胚軸生長有疊加效應(yīng)［22］，在促進擬南芥幼苗下胚軸伸長生長方面具有協(xié)同作用，同時使用兩種激素的下胚軸長度要比單獨使用一種激素的高出3～4倍［23］。本研究結(jié)果與已有的研究基本一致。同時發(fā)現(xiàn)，使用2，4-表油菜素內(nèi)酯和GA3處理后的羊草種子發(fā)芽率要比單一使用GA3或2，4-表油菜素內(nèi)酯高出20%～30%，這說明2，4-表油菜素內(nèi)酯和GA3在促進羊草種子萌發(fā)方面具有疊加效應(yīng)。在促進羊草種苗生長方面，雙激素處理后，羊草種苗的苗長和根長均可顯著增加，可實現(xiàn)在促進幼苗生長的同時，彌補GA3對根長的抑制作用，兩者在促進種苗生長方面表現(xiàn)出了顯著的協(xié)同效應(yīng)。

4 結(jié)論

1）2，4-表油菜素內(nèi)酯濃度在0.01～0.1 μg·g-1內(nèi)時，能夠促進羊草種子萌發(fā)和種苗生長，尤其是對根的促進效果更加明顯。

2）對于羊草種子萌發(fā)及種苗生長，2，4-表油菜素內(nèi)酯和赤霉素存在顯著的互作效應(yīng)，綜合考慮羊草種子發(fā)芽率、根長和苗長，以2，4-表油菜素內(nèi)酯0.1μg·g-1＋GA3200μg·g-1、2，4-表油菜素內(nèi)酯0.01μg·g-1＋ GA3200μg·g-1效果最好。

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