李曉潁， 張紅醫(yī)， 常巧英， 范春林＊， 龐國芳， 曹 喆， 王雯雯

（1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北 保定071002；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京100123；3.安捷倫科技有限公司，北京100102）

世界范圍內常用的農藥有千余種，這給農藥的檢測帶來了一定的難度。目前農殘檢測過程主要包括樣品前處理與檢測部分。常用的農藥多殘留前處理技術主要有基質固相分散萃?。?-4］、固相萃取［5-7］、凝 膠 滲 透 色 譜［8］以 及QuEChERS 法［9-11］等。檢測方法以色譜-質譜聯(lián)用技術為主，常見的有氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GC-MS／MS）［2-4，12］、氣相色譜-質譜 法（GC-MS）［13，14］、液 相 色 譜-串 聯(lián) 質 譜 法（LC-MS／MS）［11，15，16］、氣 相 色 譜-飛 行 時 間 質 譜 法（GC-TOF MS）［17-22］、液相色譜-四極桿飛行時間質譜（LC-QTOF MS）［23-25］等。近 年 來 高 分 辨 質 譜（HR-MS）的應用也為殘留分析提供了可靠依據。

GC-TOF MS分析方法通常評價3～5個特征離子，要求兩個及以上特征離子出峰且離子豐度比在特定范圍內（定性點大于4）作為定性依據［26，27］。但該方法僅適合于具有一定數(shù)量特征離子且出峰良好的化合物的測定。在實際樣品分析過程中，存在目標物含量低、干擾嚴重等現(xiàn)象，導致目標離子并非完全出現(xiàn)，離子豐度比變化較大。Portolés等［22］就曾指出在低濃度下離子豐度偏差大，很難符合定性限定要求。此外，有些農藥的譜圖只有1～2個特征離子，按照前述方法定性面臨困難。近年隨著儀器的發(fā)展已將四極桿-飛行時間質譜應用于氣相色譜分析當中，通過二級質譜測定與配套數(shù)據分析軟件的使用可實現(xiàn)化合物的準確鑒定。2010 年，Portolés等［28］使用大氣壓化學電離源氣相色譜-四極桿飛行時間質譜（APGC-QTOF MS）進行農藥殘留 分 析。2012 年，Canellas 等［29］描 述 了APGCQTOF MS用于包裝污染物的鑒定。2012年，Zhang等［30］應用GC-QTOF MS同時建立了187種農藥一級與二級精確質量數(shù)據庫用于蔬菜中農藥殘留檢測，采用離子對（母離子-子離子）方式進行庫檢索分析。該方法雖實現(xiàn)了二級質譜確證分析，但評價離子個數(shù)有限。到目前為止，應用GC-QTOF MS 建立二級譜圖庫，進行譜圖檢索與鏡像對比確證分析尚未見報道。

本文分別建立了152種常見農藥的GC-QTOF MS一級精確質量數(shù)據庫與相應農藥二級譜圖庫。應用一級數(shù)據庫對具有足夠明顯特征離子的農藥進行鑒定，對部分疑似農藥進行二級確證，該方法可實現(xiàn)常見果蔬中農藥殘留的準確鑒定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫7200 GC-QTOF MS（安捷倫科技公司，美國）；移液器（Eppendorf公司，德國）；SR-2DS水平振蕩器（TAITEC 公司，日本）；低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；N-EVAP112氮吹儀（OA-SYS公司，美國）；8893 超聲波清洗儀（Cole-Pamer公司，美國）；TL-602L 電子天平（Mettler公司，德國）；80 mL塑料離心管若干。

152種農藥標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于95%；乙腈、正己烷和甲醇等有機溶劑均為色譜純（Honeywell公司，美國）；乙酸、NaCl和無水MgSO4均為分析純（西隴化工股份有限公司）；提取液：含1%（v／v）醋酸乙腈；洗脫液：乙腈-甲苯（3∶1，v／v）；Carbon NH2SPE 柱（Waters公司）。果蔬樣品均購自各大超市。

農藥單標準溶液的配制：準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）各種農藥標準品分別置于10 mL容量瓶中，根據標準物的溶解性和測定的需要分別用甲醇、甲苯和丙酮等溶劑溶解并定容至刻度，于4℃下避光保存。

農藥混合標準溶液的配制：為了實現(xiàn)藥物的更好分離，根據每種農藥的化學性質和保留時間把農藥分成A、B 兩組，每組混合標準農藥為70 余種。根據單標準溶液的濃度，準確移取一定體積的每種單標準溶液至25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，使混合標準溶液中每種農藥的質量濃度均為10 mg／L，于4 ℃下避光保存。

1.2 色譜條件

氣相色譜柱為VF-1701 ms質譜專用柱（30 m×0.25 mm×0.25μm；安捷倫公司，美國）。程序升溫過程：40 ℃下保持1 min，然后以30 ℃／min升溫至130 ℃，再以5 ℃／min升溫至250 ℃，再以10℃／min升溫至300 ℃，保持5 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.2 mL／min；進樣口溫度：290℃；進樣量：1μL；進樣方式：不分流進樣；環(huán)氧七氯用于校正保留時間。

1.3 質譜條件

電子轟擊電離源（EI源）電壓：70 eV；離子源溫度：230 ℃；GC-MS接口溫度：280 ℃；溶劑延遲：6 min。一級質譜質量掃描范圍：m／z 50～600；采集速率：2 spectra／s；二級質譜質量掃描范圍：m／z 50～400；采集速率：200 ms／spectrum；對m／z 264的分辨 率 為14 000（半 高 峰 寬（FWHM））；安 捷 倫MassHunter工作軟件。

1.4 樣品前處理

取足量的果蔬樣品粉碎，混勻。稱取10.0 g上述樣品于80 mL具塞離心管中，加入40 mL含1%醋酸的乙腈提取液，高速勻漿機均質1 min，加入1 g NaCl、4 g無水硫酸鎂，振蕩提取10 min，于4 200 r／min下離心5 min；取20 mL上清液至150 mL雞心瓶中，旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至2 mL 左右。在Carbon NH2柱中加入2 cm 高無水硫酸鈉、4 mL洗脫液活化。將濃縮液移至SPE 柱，下接80 mL 雞心瓶，流出液自然滴入雞心瓶中；將150 mL雞心瓶用2 mL洗脫液潤洗3次，均轉移至SPE 柱中，最后將SPE柱用25 mL洗脫液洗脫，流出液全部收集至雞心瓶中。將流出液在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至1～2 mL，氮吹至近干，用1 mL 正己烷定容，過0.2μm濾膜至進樣小瓶，濾液供GC-QTOF MS分析。

2 結果與討論

按照1.4節(jié)的前處理方法提取、凈化樣品，進行一級全掃描（scan）測定；對測定結果進行一級數(shù)據庫檢索，實現(xiàn)部分農藥的確證（以3個及以上特征離子符合條件且豐度比合適為鑒定依據），并發(fā)現(xiàn)疑似農藥（即特征離子出峰情況不足以定性農藥）；之后對含有疑似農藥的樣品在二級最佳碰撞誘導解離（CID）能量下進行測定；經二級譜圖庫檢索實現(xiàn)疑似農藥的確證。農藥的檢測與確證過程見圖1。

2.1 一級精確質量數(shù)據庫特征離子信息

圖1 農藥檢測與確證流程圖Fig.1 Flowsheet of pesticide detection and identification

一級質譜.csv格式數(shù)據庫包含每種農藥的保留時間、特征離子分子式、精確Mr。特征離子分子式的計算需對農藥標準品進行測定，并在軟件中給定農藥元素組成信息，軟件生成分子式后結合農藥結構進行驗證，并以此計算理論Mr。每種農藥包含3～5個特征離子，部分特征離子信息見表1。

表1 152種農藥部分特征離子信息Table 1 Part information of the characteristic ions of 152 pesticides

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2.2 二級質譜圖庫的建立

2.2.1 母離子選擇原則

對所有農藥采集了最佳CID 下的二級質譜圖，每種農藥選擇1個特征離子作為母離子進行二級質譜采集，原則如下：（1）選擇豐度最高的離子作為母離子；（2）當豐度最高的離子的Mr較低時，為了獲得準確、豐富的碎片信息，應選擇次高豐度但Mr較大的特征離子作為母離子。

2.2.2 優(yōu)化二級質譜最佳的CID 能量

分別對每種農藥采集了5、10、15、20、25 和30 eV CID 能量下的二級質譜圖，根據不同碰撞能下母離子的碎裂程度，選擇二級質譜圖中特征離子明顯、分布均勻、響應良好的二級質譜圖作為最佳CID 質譜圖。圖2為o，p′-DDD 最佳CID 譜圖的選擇過程。由此可見，碰撞能的高低影響二級質譜特征離子的豐度。碰撞能過高（20 eV 以上）時，離子碎裂程度較大，特征離子的豐度普遍較低，不適宜作為最佳的碰撞能量；碰撞能量過低（5 eV）時，母離子碎裂程度差，豐度高，子離子豐度均較低，特征性差，同樣不宜作為最佳碰撞能。當CID 能量為10 eV 時，各特征離子均有較高的豐度，故選擇10 eV 為最佳CID 能量。本實驗按此方法優(yōu)化了每種農藥的最佳CID 能量，并建立了二級質譜特征離子.xml譜圖庫。

2.3 二級質譜采集速率對測定結果的影響

采集速率影響信號強度與峰形［21］。本文考察了不同采集速率對二級質譜測定結果的影響。在果蔬基質中分別添加15 種常見農藥至1、2、5、10 μg／kg 4 個水平，在不同采集 速率（150、200、300、400、500 ms／spectrum）下測定，結果顯示當采集速率為200 ms／spectrum 時農藥二級質譜的檢出情況最佳（見圖3），與數(shù)據庫匹配程度良好，因此實驗選擇采集速率200 ms／spectrum 為二級質譜的采集速率。

2.4 TOF MS數(shù)據分析

TOF MS的優(yōu)勢在于其精確質量全掃描能力與窄質量窗口提?。?1］。采用窄質量窗口有效降低了背景干擾，提高了信噪比。質量偏差（ppm）是化合物準確定性的一項重要依據，質量偏差大小影響離子出峰的真實性。通過建立一級精確質量數(shù)據庫，在定性軟件Find compound by formula下進行特征離子提取，設定提取窗口為20 ppm，軟件將依據數(shù)據庫中的保留時間、特征離子分子式、理論相對分子質量及同位素分布情況對實測離子進行評價，通過該方法可實現(xiàn)部分農藥的一級確證及發(fā)現(xiàn)疑似農藥。圖4是甘藍中添加敵敵畏5μg／kg時特征離子的檢出情況。由圖4可知，所選擇的敵敵畏4個特征離子均有檢出，質量偏差均小于5 ppm，豐度比合適。這種情況可以作為定性依據，符合歐盟的相關要求。

圖2 o，p′-DDD 二級質譜特征離子豐度隨CID 能量變化情況Fig.2 Relationships of characteristic ion intensities and CID energies of o，p′-DDD in MS2

圖3 不同二級質譜采集速率下15種農藥的檢出情況Fig.3 Detection of 15 pesticides at different MS2acquisition rates

圖4 添加敵敵畏5μg／kg的甘藍樣品的提取離子流圖（20 ppm）Fig.4 Extracted ion chromatograms（20 ppm）of dichlorvos spiked in cabbage at 5μg／kg

對于特征離子較少的農藥，僅通過一級質譜數(shù)據很難做出準確的判斷，如圖5 所示，以cis-permethrin為例，添加水平分別為2μg／kg和5μg／kg時，特征離子m／z 183出峰明顯，但其他兩個離子的出峰情況均較差，低添加水平（如2μg／kg）時，這種現(xiàn)象更加明顯，其余兩個離子幾近未出峰，難以判斷。這種情況下需進行二級質譜特征譜圖分析，做進一步判斷；同樣農藥perthane則只能看到m／z 223明顯出峰，其他離子響應極低，單憑一個特征離子難以準確定性。

圖5 添加不同水平的cis-permethrin與perthane的甘藍樣品的提取離子流圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of cis-permethrin and perthane spiked in cabbage at different concentrations

通過上述方法對一級質譜數(shù)據進行分析，可以對部分農藥進行準確定性，并發(fā)現(xiàn)疑似農藥；對于疑似農藥還需進行二級確證。

2.5 二級質譜結果分析

二級質譜測定主要針對一級質譜未能完全定性的農藥，包括本身缺少特征離子的農藥；亦包括在某些基質干擾情況下，部分特征離子未能檢出，不滿足定性要求的情況。仍以cis-permethrin為例，母離子m／z 183在添加水平為2μg／kg、CID 為20 eV 時二級譜圖庫檢索后的鏡像結果（見圖6）表明，庫匹配良好。顯然，在一級質譜不足以定性的情況下，有必要進行二級質譜確證。

二級處理過程需根據疑似農藥編輯數(shù)據采集方法并對樣品重新測定，在定量軟件中應用Find compound by target MS／MS 提取二級質譜結果，再經Search unit mass library進行譜庫檢索，并給出鏡像對比結果，進而實現(xiàn)疑似農藥的進一步確證。該方法提高了農藥的鑒定準確度，彌補了一級TOF MS鑒定的不足之處。

圖6 甘藍樣品中添加2μg／kg cis-permethrin的二級質譜鏡像結果Fig.6 MS2 spectral difference result of cis-permethrin spiked in cabbage at 2μg／kg

2.6 方法學驗證

2.6.1 回收率

本文根據農藥的一級質譜特征離子建立了一級質譜定量處理軟件，將最高豐度的離子作為定量離子，其他次高豐度的離子作為定性離子。在甘藍、番茄、梨3種樣品中分別添加5.0和10.0μg／kg標準品并測定回收率。并按照歐盟SANCO／825／00［32］要求，對回收率進行評價。統(tǒng)計結果顯示，在上述兩種添加水平下回收率在70%～120%之間的農藥比例在甘藍基質中分別為91.45%、94.08%，在番茄基質中分別為88.20%、88.80%，在梨基質中分別為86.84%、92.10%，測定結果符合相關要求。

2.6.2 檢出限和定量限

在甘藍、番茄、梨3 種空白基質中分別添加1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg／kg系列水平的目標物標準品，按建立的方法進行樣品前處理及測定，建立基質標準曲線，結果顯示3種基質中線性相關系數(shù)r2﹥0.990 的 農 藥 比 例 分 別 為94.7%、96.7%、93.4%。以S／N ＝3 和S／N ＝10 分別計算方法的LOD 和LOQ，其范圍分別為甘藍0.01～9.19μg／kg 和0.05～30.65μg／kg，番 茄0.01～9.19μg／kg和0.03～30.62μg／kg，梨0.02～42.8 μg／kg和0.06～141.6μg／kg（152種農藥的線性相關系數(shù)、LOD、LOQ 數(shù)據略）。線性范圍為1～2個數(shù)量級，適合1～50μg／kg含量水平分析。

2.7 實際樣品分析

本實驗在4個不同地點采集了蘋果、芹菜、梨、桃子、甘藍、番茄6種果蔬共24個樣品，按照建立的方法進行前處理及檢測，通過基質標準曲線定量，檢測結果見表2，部分農藥進行了二級質譜確證，鏡像結果見圖7。從實際樣品檢測結果看，毒死蜱的檢出率較高，占68.8%，由此可見在農藥使用過程中，毒死蜱的使用率較高；農藥殘留水平大多處于10 μg／kg以下，超標情況較少。但在第3批芹菜中五氯硝基苯（quintozene）與戊唑醇（tebuconazole）的檢出含量較高，嚴重超歐盟限量20倍與50倍，這兩種農藥均為目前使用較廣的低毒農藥，但其高含量仍令人擔憂。其次檢出了部分國家全面禁止使用的藥物，如芹菜中檢出beta-HCH 等。

表2 實際樣品中檢出的農藥種類及其含量Table 2 Kinds and contents of pesticides found in real samples

圖7 芹菜樣品中檢出quintozene的二級質譜鏡像對比Fig.7 MS2 spectral difference result of quintozene found in a celery sample

3 結論

基于GC-QTOF MS分別建立了152種常見農藥的一級精確質量數(shù)據庫與二級譜圖庫。實驗基于SPE法，以1%醋酸乙腈與Carbon NH2柱對樣品進行提取與凈化，實現(xiàn)了對152種常見農藥的準確鑒定。通過應用QTOF二級譜圖檢索，實現(xiàn)了對某些一級質譜特征離子數(shù)較少的農藥與基質干擾下出峰情況不佳農藥的進一步確證，提高了鑒定的可靠性，同時擴大了農藥的分析范圍。該方法是復雜基質中農藥準確鑒定的可靠途徑。

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