熊 山， 李敬來， 朱秀清， 王曉英， 呂圭源， 張振清＊

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京100850）

莫諾苷（結(jié)構(gòu)見圖1）是從中藥山茱萸（Cornus officinalis Sieb.＆Zucc.）中提取分離獲得的環(huán)烯醚萜苷類化合物［1］。研究表明，山茱萸環(huán)烯醚萜苷具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤等，并對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護作用。其中，莫諾苷能抑制過氧化誘導的神經(jīng)細胞損傷，促進人神經(jīng)上皮瘤細胞（SH-SY5Y）的生長，并提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力，對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的神經(jīng)保護作用［2-4］。

圖1 莫諾苷的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of morroniside

在藥效學實驗的基礎(chǔ)上，前期已經(jīng)應用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）建立了大鼠血漿中莫諾苷的血藥濃度測定方法，并進行了莫諾苷大鼠體內(nèi)的藥代動力學及組織分布研究。結(jié)果顯示，大鼠單劑量灌胃給藥20 mg／kg，計算得到的主要藥代動力學參數(shù)：AUC（0-∞）為（587.6±290.7）μg／L·h，Cmax為（334.2±148.0）μg／L，Tmax為（0.6±0.3）h，t1／2為（0.7±0.3）h［5］。在大鼠組織分布研究中，大鼠單劑量灌胃給藥30 mg／kg后，莫諾苷在大鼠體內(nèi)的吸收和分布較快，藥物入血后在體內(nèi)各個組織分布較為廣泛，大部分組織均在45 min達到藥物濃度最高值；藥物在組織中的消除也比較快，6 h后藥物在組織中基本消除完畢［6］。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用LC-MS／MS技術(shù)建立了比格犬血漿中莫諾苷的檢測方法，優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜的各項條件，進行了系統(tǒng)的方法學驗證，并應用于藥代動力學研究，以探討莫諾苷在比格犬體內(nèi)的變化規(guī)律。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

莫諾苷（HPLC 測定純度大于98.5%）由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究所提供；芍藥苷對照品（批號：110736-201035，純度：96.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈和甲醇購自美國Fisher Scientific公司；分析純甲酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；水為純凈水。

1.2 儀器與軟件

API 5000 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，Analyst 1.5.2質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB公司）；Shimadzu LC-20AD 二 元 泵，SIL-20AHT 自 動 進 樣 器，CTO-20A 柱溫箱（日本島津公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；Denver T-214電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；高速低溫離心機（美國Thermo Scientific公司）；DAS 2.0軟件（由皖南醫(yī)學院孫瑞元和鄭青山教授主編）。

1.3 實驗動物

比格犬5只，雄性，體重（10±2）kg，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（軍）2007-004。

1.4 LC-MS／MS條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP柱（50 mm×2.1 mm，5μm）；流動相：水（含1 mmol／L 甲酸鈉，A），乙腈（B）；梯度洗脫：0～0.5 min，5%B～20%B；0.5～1.0 min，20%B～70%B；1.0～3.0 min，70%B～95%B；3.0～3.2 min，95%B～5%B；3.2～6 min，5%B；流速：0.4 mL／min；進樣量：10μL；柱溫：20 ℃；分析時間：6 min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

檢測離子對分別選擇：m／z 429.1→267.3（莫諾苷），m／z 503.4→341.2（芍藥苷），兩個化合物的檢測離子均選擇［M＋Na］＋峰。電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應監(jiān)測（MRM）；莫諾苷與內(nèi)標芍藥苷的離子源電壓（IS）：5 kV；源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）流速：25 L／h；碰撞氣（CAD）流速：12 L／min；錐孔氣流速（Gas1）：45 L／min；去溶劑氣流速（Gas2）：45 L／min；去簇電壓（DP）：180 V；入口電壓（EP）：10 V；碰撞能（CE）：35 V；碰撞池出口電壓（CXP）：15 V。

1.5 血漿樣品處理

取待測比格犬血漿50μL，加入50μL純凈水，混勻，再分別加入100μL芍藥苷溶液（500μg／L）和150μL 甲醇，充分振蕩1 min 后，以14 000 r／min離心10 min，取上清液進樣10μL。

2 結(jié)果

2.1 特異性

空白比格犬血漿、比格犬血漿加標樣品和比格犬灌胃后1 h的典型色譜圖見圖2。莫諾苷和內(nèi)標芍藥苷的保留時間分別為1.96和2.06 min，峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾莫諾苷和內(nèi)標的測定。

2.2 標準曲線與定量限

用純凈水將莫諾苷儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為2、10、50、400、2 000 和5 000μg／L 的 系 列 標 準 溶液，取空白比格犬血漿50μL加入50μL 標準溶液混勻，其他操作同1.5 節(jié)所述，LC-MS／MS 方法測定。質(zhì)控樣品的制備、處理及測定同上，標準液的濃度分別為5、200 和4 000μg／L（低、中、高3 種 濃度）。采用加權(quán)最小二乘法計算標準曲線方程，以莫諾苷與內(nèi)標的峰面積比值為Y，以莫諾苷的質(zhì)量濃度為X，得 到 的 回 歸 方 程 為Y ＝0.003 86 X ＋0.014 6（n＝5），權(quán)重因子W ＝1／X2，相關(guān)系數(shù)r＝0.996 6。相對標準偏差（RSD）均在《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則》（2005年）規(guī)定范圍之內(nèi)。定量限為2μg／L。

圖2 （a）空白犬血漿樣品、（b）空白犬血漿加標（莫諾苷2μg／L和內(nèi)標）樣品及（c）灌胃莫諾苷（15 mg／kg）后比格犬血漿樣品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of（a）blank beagle plasma，（b）blank beagle plasma spiked with morroniside（2μg／L）and internal standard and（c）a beagle plasma sample after intragastric（ig）administration of a 15 mg／kg dose of morroniside

2.3 精密度與準確度

用空白比格犬血漿配制低、中、高3個濃度（同質(zhì)控樣品）的樣品各5份，連續(xù)測定3 d，用隨行標準曲線計算相應的藥物濃度，分別考察批內(nèi)和批間精密度與準確度。實驗結(jié)果表明，低、中、高3個濃度的批內(nèi)和批間RSD 均小于12%，準確度為89%～111%，結(jié)果見表1。

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應

提取回收率為空白血漿中加入藥物經(jīng)提取后的藥物響應值與空白血漿處理后加入相同量藥物響應值的比值；基質(zhì)效應為具有基質(zhì)的標準品與純標準品的目標化合物的響應強度的比值。實驗樣品為質(zhì)控樣品（n＝3）。莫諾苷在低、中、高3個濃度的提取回收率 分 別 為（78.65±1.77）%、（83.33±1.14）%、（88.59±1.82）%，回收率符合要求且穩(wěn)定；基質(zhì)效應分別為（100.06±5.64）%、（94.92±0.77）%、（83.40±1.89）%，因此可忽略基質(zhì)效應的影響。

表1 比格犬血漿中莫諾苷測定方法的精密度和準確度（n＝5）Table 1 Precision and accuracy of the assay method for morroniside in the beagle plasma（n＝5）

2.5 穩(wěn)定性考察

配制莫諾苷低、中、高3個濃度（5、200和4 000 μg／L）的比格犬血漿樣品（同質(zhì)控樣品，n＝5）。室溫放置6 h后，低、中、高3個濃度對應的測定結(jié)果分別為（4.99±0.32）μg／L、（210.20±6.61）μg／L、（3 562.00±132.55）μg／L；上清液樣本在自動進樣器中存放24 h后，對應的測定結(jié)果分別為（5.06±0.38）μg／L、（214.40±7.30）μg／L、（3 718.00±135.54）μg／L；莫諾苷血漿樣本冷凍20 d后，對應的測定結(jié)果分別為（4.98±0.40）μg／L、（189.20±6.30）μg／L、（3 548.00±133.30）μg／L。結(jié) 果 表明，在上述穩(wěn)定性考察條件下，莫諾苷各濃度的測定值與實際值相近，準確度高，表明莫諾苷在上述貯存及測定過程中均是穩(wěn)定的。

2.6 莫諾苷在比格犬體內(nèi)的藥代動力學研究［7］

按照莫諾苷5、15和45 mg／kg的給藥劑量單次給予比格犬灌胃給藥。

將5只比格犬編號并稱重，分3個周期分別給予3個劑量的藥物，清洗期為1周，自由飲水。于給藥前禁食12 h，自由飲水。于給藥前及給藥后5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h由腿靜脈分別取血1 mL，于3 000 r／min離心15 min，將血漿于-30 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

比格犬單次灌胃給予莫諾苷后的平均血藥濃度-時間曲線見圖3；將動物種屬、給藥劑量、給藥方式和測得的血藥濃度等信息輸入DAS2.0軟件，處理后得到主要藥代動力學參數(shù)見表2。對藥-時曲線下的面積AUC（0-∞）和劑量進行線性回歸，回歸方程為Y＝216.11 X＋632.78（Y：AUC（0-∞），μg／L·h；X：劑量，mg／kg），相關(guān)系數(shù)r 為0.999 7，說明比格犬灌胃莫諾苷后，呈線性藥代動力學過程。

表2 比格犬灌胃3個劑量莫諾苷后的主要動力學參數(shù)（mean±SD，n＝5）Table 2 Pharmacokinetic parameters of morroniside after ig administration of three level doses in beagles（mean±SD，n＝5）

圖3 比格犬單次灌胃莫諾苷的平均血藥濃度-時間曲線（mean±SD，n＝5）Fig.3 Mean concentration-time curves of morroniside after single ig administration in beagles（mean±SD，n＝5）

3 結(jié)論

本研究運用LC-MS／MS聯(lián)用技術(shù)建立了比格犬血漿中莫諾苷血藥濃度的檢測方法，該方法簡便、特異性強，為莫諾苷的動力學研究提供了穩(wěn)定、可靠、方便的檢測手段。研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷在比格犬體內(nèi)的AUC（0-∞）與劑量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，提示其為線性動力學過程，并且主要的藥代動力學參數(shù)MRT、t1／2z、Tmax、CLz、和Vz在各劑量組中無顯著性差異。本研究建立的檢測方法以及比格犬體內(nèi)的動力學結(jié)果為今后全面評價莫諾苷的體內(nèi)外代謝性質(zhì)打下了良好的基礎(chǔ)。

［1］ Xie X Y，Wang R，Shi Y P.Biochem Syst Ecol，2012，45：120

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［3］ Wang W，Huang W T，Li L，et al.Cell Mol Neurobiol，2008，28（2）：293

［4］ Wang W，Xu J D，Li L，et al.Brain Res Bull，2010，83（5）：196

［5］ Xiong S，Li J L，Zhu X Q，et al.China Journal of Chinese Materia Medica（熊山，李敬來，朱秀清，等.中國中藥雜志），2013，38（19）：3378

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