黃賽瓊，宋亦軍，劉俊濤

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730）

過去30年里，胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查從單純的孕婦年齡篩查到不同模式的母血清學(xué)篩查，檢出率和準(zhǔn)確度均逐漸提高。最近，隨著基因測序和生物信息領(lǐng)域的進(jìn)展，出現(xiàn)了檢出率和準(zhǔn)確度近似于產(chǎn)前診斷的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測方法（noninvasive prenatal testing，NIPT）。認(rèn)識胎兒非整倍體檢測的歷史進(jìn)展和近幾十年分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，能更好地理解NIPT 及這一新方法在分子水平的應(yīng)用前景。

一、傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查進(jìn)展

1984年，Markatz 等［1］發(fā)現(xiàn)母血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）降低與胎兒21三體、18三體等常染色體異常相關(guān)。同年Cuckle等［2］證實結(jié)合年齡和中孕期母血清AFP 的產(chǎn)前篩查方法對唐氏 綜 合 征（Down’s syndrome，DS）的 檢 出 率 為40%，假陽性率5%。之后Bogart等［3］報道孕育DS胎兒孕婦中孕期血清人絨毛膜促性腺激素β（human chorionic gonadotropinβ，βHCG）水平升高，非結(jié)合雌激素（unconjugated estriol，uE3）水平降低。1988年，Wald等［4］首先提出聯(lián)合中孕期血清指標(biāo)βHCG、AFP、uE3和孕婦年齡的篩查模式，將DS檢出率提高到61%。胎兒非整倍體篩查進(jìn)入多項孕婦血清標(biāo)志物聯(lián)合篩查的新紀(jì)元，并先后提出了中孕期篩查、早孕期篩查、早中孕期聯(lián)合篩查的模式。

1.中孕期血清學(xué)篩查：中孕期血清學(xué)篩查包括二聯(lián)（AFP＋βHCG）篩查、三聯(lián)（AFP＋βHCG＋uE3）篩查、四聯(lián)［AFP＋βHCG＋uE3＋I(xiàn)nh A（inhibin A））篩查。血清尿超聲篩查研究（the serum，urine and ultrasound screening study，SURUSS）采用前瞻性多中心方法，納入47 053例孕14～20周妊娠婦女，其中包括101例DS胎兒，以1：300為危險切割值進(jìn)行篩查。研究結(jié)果顯示，假陽性率為5%時，二聯(lián)、三聯(lián)、四聯(lián)篩查DS 檢出率分別為71%、77%、81%［5］。

目前臨床中，中孕期血清學(xué)篩查指標(biāo)也用于18三體的篩查。T18 胎兒母血清AFP、uE3和HCG 水平均降低：AFP≤0.75MoM（中位數(shù)倍數(shù)），HCG≤0.60MoM 和E3≤0.55MoM。Canick 等［6］采用固定切割值的計算方法，中孕期三聯(lián)篩查模式可檢出60%的T18胎兒，假陽性率0.4%。由于孕婦年齡和常染色體三體的發(fā)病率相關(guān)性不確切，不能合并到T18風(fēng)險評估中，Palomaki等［7］通過似然比校正年齡風(fēng)險計算每個孕婦孕育T18胎兒的風(fēng)險，設(shè)定切割值為1：100時，T18檢出率60%，假陽性率0.2%。事實上，兩種方法的檢出率和假陽性率變化比理論上變化還大。T18胎兒母血清Inh A水平比正常胎兒母血清約低25%［8］，但相關(guān)文獻(xiàn)較少。

另外，中孕期血清學(xué)篩查DS、T18高風(fēng)險的部分胎兒染色體核型可能提示45，XO，以及性染色體三倍體等。目前有研究證實伴水腫或水囊瘤45，XO 胎兒的母血清AFP、uE3水平降低，βHCG 水平升高，不伴水腫的45，XO 胎兒母血清HCG 和inhibin A 水平降低［9-10］；這與T21、T18 高危孕婦血清學(xué)變化相似。三倍體胎兒孕婦血清βHCG 水平可明顯升高或降低，uE3水平降低，AFP 水平可升高或降低［10］。

血清學(xué)篩查結(jié)果受多胎妊娠，孕周不準(zhǔn)確，或雙胎之一胚胎停育影響。中孕期血清學(xué)篩查局限性是孕婦必須等到15 周后才可進(jìn)行，故得知胎兒DS、T18異常的風(fēng)險后無法進(jìn)行早期干預(yù)。為了更早發(fā)現(xiàn)及干預(yù)DS、T18高風(fēng)險胎兒，國際血清學(xué)篩查研究轉(zhuǎn)向早孕期篩查。

2.早孕期血清學(xué)篩查：早孕期血清學(xué)篩查指標(biāo)包括妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A）和βHCG。早孕期DS胎兒母血清PAPP-A 水平降低，βHCG 水平升高；T18胎兒母血清PAPP-A 和β HCG 水平均降低。Brambati等［11］首先提出聯(lián)合β HCG、PAPP-A 和孕婦年齡進(jìn)行早孕期血清學(xué)篩查，孕8～12 周DS檢出 率78.9%。Noble 等［12］發(fā) 現(xiàn) 早 孕 期 血 清β HCG 和胎兒頸項透明層（nuchal translucency，NT）是DS篩查的獨立指標(biāo)，將NT 引入早孕期血清篩查。NT 聯(lián)合βHCG 的早孕期篩查模式的DS檢出率85%，假陽性率5%。兩年后有研究提出聯(lián)合β HCG、PAPP-A、NT 和孕婦年齡的早孕期聯(lián)合篩查模式。Wapner等［13］對8 514例10＋4～13＋6周孕婦進(jìn)行多中心早孕期聯(lián)合篩查，DS檢出率78.7%，假陽性率5%，T18 檢出率90.9%，假陽性率2%，證實早孕期聯(lián)合篩查可用于臨床。另外，多項前瞻性研究［5，13-15］發(fā)現(xiàn)假陽性率為5%時，早孕期聯(lián)合篩查DS 檢出率78.7%～85%，較中孕期檢出率高。Avgidou等［14］前瞻性研究報道孕11～13＋6周的早孕期聯(lián)合篩查假陽性率7.5%時，可檢出92.3%T18，88.9%T13，84.2%45，X 和86.1%其它染色體異常。

早孕期篩查最主要的優(yōu)勢是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，早期終止妊娠相對于中期引產(chǎn)更安全；還可以減少孕婦及家屬的焦慮。但是部分早孕期篩查提示的DS胎兒在中孕期篩查前自然流產(chǎn)，因此可能增加了不必要的人工流產(chǎn)術(shù)。絨毛染色體核型分析可能出現(xiàn)嵌合體，需要等到中孕期羊膜腔穿刺才確診是否為限制性胎盤染色體嵌合。此外，NT 篩查的準(zhǔn)確性受胎位、醫(yī)師的經(jīng)驗和技術(shù)等多種因素的影響，NT 的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性較血清學(xué)指標(biāo)差［16］。

3.早中孕期聯(lián)合篩查：早中孕期聯(lián)合篩查模式的檢出率均較單純早孕期或中孕期篩查高。早中孕期聯(lián)合篩查模式包括序貫篩查（sequential screening，SS）、整合篩查（integrated screening，IS）、酌情篩查（contingency screening，CS），詳見表1和表2。Malone等［17］的研究發(fā)現(xiàn)CS是最佳的早中孕期聯(lián)合篩查模式；當(dāng)CS假陽性率為4.3%時，DS檢出率為93%；CS 早孕期DS 檢出率為65.1%（1.5%孕婦需進(jìn)行絨毛活檢）；CS 中孕期DS 檢出率為27.9%（2.8%孕婦需進(jìn)行羊膜腔穿刺）。

臨床實踐中，不同類型的早中孕期聯(lián)合篩查模式各有優(yōu)缺點。獨立序貫篩查分別報告篩查結(jié)果，Malone等［15］報道其假陽性率11%和檢出率94%，均較高，準(zhǔn)確性降低，故不推薦使用。階段序貫篩查假陽性率4.9%低于獨立序貫篩查［17］，但早孕期低危孕婦由于費用等原因可能選擇終止篩查。完全整合篩查假陽性率4.0%較階段序貫篩查更低［15］，但孕婦均需等到中孕期得知篩查結(jié)果；大多數(shù)早孕期低?；颊卟荒軓闹性衅诤Y查獲益；早孕期高危孕婦不能早期診斷、早期干預(yù)。一方面，NT 的測量準(zhǔn)確度依賴于超聲科醫(yī)師的技術(shù)水平；另一方面，相同假陽性率情況下整合血清學(xué)篩查檢出率低于完全整合篩查，高于早孕期篩查、中孕期篩查。NT 測量水平有限的單位，可以選擇整合血清學(xué)篩查方法。酌情篩查是效價比最高的模式［17］，但是對于絨毛活檢（CVS）不成熟的醫(yī)療機構(gòu)，整合篩查是最佳選擇。

二、NIPT 在產(chǎn)前篩查領(lǐng)域的研究進(jìn)展

1.NIPT 的發(fā)現(xiàn)及臨床應(yīng)用：1997年，Lo等［18］通過聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）擴增得到母體外周血中Y染色體的特異性DNA 序列，從而證明懷有男性胎兒的母血漿中存在胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）。cffDNA 幾乎全部來源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，DNA 片段相當(dāng)小，約150bp。最早可孕5周在母血漿內(nèi)測到cffDNA，孕7周胎兒胎盤循環(huán)建立后，cffDNA 即以一定的比例穩(wěn)定存在于母體外周血中，并隨著孕周的增大而增多，約5%～30%。游離DNA 半衰期僅為16.3 min，分娩2h后母血中的cffDNA 即完全降解。早在2006年，有研究報道可用等位基因比方法從母體血漿檢測胎兒染色體非整倍體。此后，出現(xiàn)了許多基于DNA、RNA 等位基因的不同方法。同樣也出現(xiàn)了多種分析方法如數(shù)字PCR、質(zhì)譜分析法。但由于這些技術(shù)均存在局限性而未能廣泛應(yīng)用。2008 年，Chiu等［19］首次報道用大規(guī)模平 行測序（massively parallel sequencing，MPS）技術(shù)平臺檢測胎兒非整倍體，使cff DNA大規(guī)模用于臨床產(chǎn)前檢測。2011 年首個獨立的多中心NIPT 臨床研究［20］采用盲法驗證，病例對照方法，從27個中心入組4 600多例胎兒非整倍體高危的孕婦（高齡，血清學(xué)篩查陽性，超聲結(jié)果提示非整倍體，個人或家族非整倍體史，家族羅伯遜易位）。未經(jīng)校正的測序數(shù)據(jù)顯示DS檢測率98.6%（209／212），假 陽 性率0.20%（2／1 471）。應(yīng) 用 腺 苷 標(biāo) 準(zhǔn) 化 修 正（a correction for GC normalization and repeat masking）后，DS的靈敏度99.1%（210／212），特異性99.9%。同時該報道評估了使用MPS 進(jìn)行DS 無創(chuàng)檢測的測試性能，0.8%樣 本 測 試 失 敗。隨 后 多 項 研 究［21-23］證 實NIPT 用 于21 三 體、18 三 體、13 三 體 產(chǎn) 前 篩 查 有良好的臨床有效性（表3）。

表1 早中孕期聯(lián)合篩查模式分類［15，17］

表2 不同早中孕聯(lián)合篩查模式篩查效率比較［17］（%）

表3 T21、T18、T13的NIPT 篩查效率

另外，部分研究組用目標(biāo)區(qū)域擴增測序法檢測目標(biāo)染色體（12、18、13、X、Y）。根據(jù)是否基于單核苷 酸 多 態(tài) 性（single nucleotide polymorphism，SNP），目標(biāo)區(qū)域擴增測序法被分為兩類。Norton等［24］進(jìn)行前瞻性多中心隊列研究并證實用DANSR（digital analysis of selected regions）方 法 和FORTE（fetal-fraction optimized risk of trisomy evaluation）方法進(jìn)行風(fēng)險評估，DS檢測靈敏度和特異度分別為100%和99.97%，T18檢測的靈敏度和特異度分別為97.4%和99.93%。另一類基于SNP的目標(biāo)區(qū)域擴增法是通過多重PCR 技術(shù)擴增13、18、21、X 和Y 染色體上的SNP 位點后高通量測序擴增片段來獲得母體和胎兒的基因型及等位基因頻率信息。Zimmermann 等［25］用這種目標(biāo)區(qū)域擴增法檢測166例樣本，檢出全部非整倍體病例（包括2例T13，3例T18，11例T21，2例45，XO，2例47，XXY）。它潛在的優(yōu)勢是能減少大量無用信息，提高檢測的效率及靈敏度。但目前尚無大規(guī)模臨床研究結(jié)果。由于當(dāng)時已經(jīng)發(fā)表的研究僅限于非整倍體高危人群，所以2012年國際產(chǎn)前診斷學(xué)會（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD），美國婦產(chǎn)科學(xué)會（The American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）與美國母胎醫(yī)學(xué)會（The Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM），中國產(chǎn)前診斷技術(shù)專家組均只建議T21、T18、T13高危孕婦進(jìn)行NIPT 檢測［26-28］。但之后Song等［29］和Faibrother等［30］研究分別比較了低齡人群中孕期血清學(xué)篩查，早孕期聯(lián)合篩查與NIPT的篩查效率，均證實NIPT 的假陽性率更低，可明顯減少侵入性產(chǎn)前診斷，同時減少操作相關(guān)的不良后果。考慮到NIPT 昂貴的篩查費用，美國把NIPT作為二線篩查方案用于早孕期或中孕期篩查陽性孕婦，但這種篩查模式不能改善假陰性率，可能漏診10%～15%DS［31］。邊旭明［32］在國內(nèi)外臨床專家討論的基礎(chǔ)上，總結(jié)了NIPT 在產(chǎn)前篩查／產(chǎn)前診斷體系里5種可能的模式供選擇。（表4）。

表4 無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測的幾種不同臨床路徑［32］

2.NIPT 的局限性及相關(guān)研究：NIPT 的局限性包括：（1）目前篩查目標(biāo)疾病僅針對21 三體、18三體、13三體；（2）以下因素均可以通過cff DNA濃度影響NIPT 結(jié)果的準(zhǔn)確性：孕婦體重、孕周、非整倍體類型、多胎妊娠、嵌合體；（3）限制性胎盤嵌合體、孕婦本人嵌合體、雙胎之一胎死宮內(nèi)或胚胎停育，或者孕婦本人患惡性腫瘤疾病等均可影響NIPT 陽性結(jié)果與染色體核型的一致性。針對NIPT 的局限性，一些研究分析了可能的原因，并報道了與其相關(guān)的新進(jìn)展。

關(guān)于孕婦體重指數(shù)肥胖孕婦cff DNA 濃度降低，可能與增加的循環(huán)血量稀釋cff DNA 有關(guān)［33］；游離DNA 總量隨體重指數(shù)按比例增加，而cff DNA不增加，即相當(dāng)于cff DNA 濃度降低［34］。

關(guān)于胎兒非整倍體類型與染色體核型正常胎兒游離DNA 比較，T21 胎兒游離DNA 濃度增加，T18、T13、45，XO 則減少［35］。

關(guān)于多胎妊娠NIPT 檢出所有非整倍體胎兒，DS中位Z值為12.3［36］，如果雙胎染色體核型一致則非整倍體Z值應(yīng)該與cff DNA 呈線性相關(guān)，處理方法同單胎妊娠；因為cff DNA 含量不是翻倍，如果雙胎非整部體核型不一致，則多胎妊娠每個胎兒的游離DNA 濃度減少，其中大約10%～15%病例游離DNA 濃度低于4%，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，香港中文大學(xué)研究組通過專有算法識別孕婦和胎兒序列不同的基因區(qū)域［37］來快速確認(rèn)雙合子雙胎，并進(jìn)一步計算評估雙合子雙胎的每個胎兒的游離DNA 濃度是否足夠［38］。

關(guān)于性染色體起初MPS檢測常染色體非整倍體胎兒的研究發(fā)現(xiàn)性染色體非整部體的檢出率較低［21］。這可能與X 染色體GC 含量導(dǎo)致的測序偏移，X、Y 染色體標(biāo)記序列相似，Y 染色體偏小，孕婦或胎兒嵌合體有關(guān)［39］。采用染色體核型和NIPT同時檢測試驗?zāi)０逯械? 546例樣本的性染色體異常，總敏感度100%（95%CI 82.3%～100%），假陽性率0.1%（95%CI 0%～0.3%），失敗率6%（95%CI4.9%～7.4%）。在單盲試驗設(shè)計中，這種方法的敏感度96.2%（95%CI 78.4%～99.8%），假陽性率0.3%（95%CI 0%～1.8%），檢測失敗率5%（95%CI 3.2%～7.7%）。191 例染色體核型為女性的樣本中MSP檢測結(jié)果4例男性，1例45X 假陽性，1例45X 假陰性，185例檢測準(zhǔn)確（167例XX，17例XO，1例XXX），199例男性樣本中1例檢測為女性，其他樣本NIPT 結(jié)果與染色體核型一致為（191例XY，5 例XXY，2 例XYY）。Guex等［40］用改良的方法處理性染色體GC 序列偏移；有文獻(xiàn)［41］報道，用SNP 分析性染色體避開X 染色體的生物學(xué)特性來改善NIPT 性染色非整倍體檢出率。

3.NIPT 的展望：在相當(dāng)短的時間里，已經(jīng)利用cff DNA 進(jìn)行NIPT 測試，并應(yīng)用于常見胎兒染色體非整倍體檢測。未來NIPT 的臨床應(yīng)用進(jìn)展最可能延伸至胎兒亞顯微染色體異常［31］。Peters等［42］證實，可以通過母體血漿游離DNA 檢測胎兒染色體微缺失如22q11.2，也稱DiGeorge 綜合征。Lo等［43］構(gòu)建的基因組水平檢測染色體復(fù)制數(shù)量異常的框架證明，染色體微缺失或微重復(fù)檢測不需要基因分析方法的根本變化，只需要新的測序數(shù)據(jù)計算函數(shù)。雖然cffDNA 檢測染色體微缺失、微重復(fù)開始轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用，但它的廣泛應(yīng)用取決于測序深度和分析的費用。另外，Lo等［44］證明可以通過母血漿內(nèi)的cff DNA 重建胎兒全基因。但利用cffDNA重建胎兒全基因方法的臨床應(yīng)用仍需要進(jìn)一步的研究。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，無創(chuàng)胎兒染色體核型分析成本降低后也可能替代染色體核型分析。連續(xù)流式PCR（continuous-flow polymerase chain reaction，CF-PCR）芯片、熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization，F(xiàn)ISH）和 微 陣 列 芯 片（microarrays）分析為目前應(yīng)用前景較好的方法。

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