殷 紫 張二飛 武小月

（1.淮陰衛(wèi)生高等?？茖W校，江蘇 淮安 223300；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術學院，江蘇 淮安 223300）

丹參是唇形科鼠尾草屬植物，因其種子發(fā)芽率低，所以一般不采用種子繁殖[1]。發(fā)育不良、種子發(fā)芽率低和品質退化是導致丹參成活率和產量較低的主要原因。近年來，隨著丹參越來越多的被人們應用于臨床試驗,大量的丹參遭到人們的挖采，丹參資源日益減少，有些稀有品種已瀕臨滅絕。丹參具有豐富的藥理作用。能有效的治療冠心??；抑制體外腫瘤細胞的增殖[2]；具有抗菌消炎的作用[3]；是醫(yī)治心腦血管系統(tǒng)疾病不可或缺的藥物。

多倍體藥用植物一般具有根、莖、葉和花果的巨型性,抗逆性強,藥用成分含量高等特性,這正是藥材優(yōu)質、高產育種所期望達到的目標[4]。多倍體誘導的方法有很多。取得了不錯應用效果。石蔭坪[5]利用棗子的胚乳，培養(yǎng)出了三倍體苗木。胚乳培養(yǎng)缺點就是愈傷組織繼代培養(yǎng)時會出現(xiàn)變異的染色體，最后會出現(xiàn)雜合體、嵌合體、二倍體的再生植株。陳柏君[6]等誘導黃芩同源四倍體時采用組織培養(yǎng)的方法先獲得愈傷組織，然后轉移到分化培養(yǎng)基上誘導生芽，當培養(yǎng)基上長出綠色芽點時，將帶芽點的愈傷組織置于含有秋水仙素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，或放入秋水仙素水溶液中浸泡，最后依次經分化及生根培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得再生植株。陳素萍.等也利用組織培養(yǎng)技術成功誘導了黨參多倍體，獲得了大批量的再生植株。

1 實驗材料、試劑和儀器

1.1 實驗材料

丹參的幼苗；葉片；愈傷組織

1.2 實驗試劑

1）娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司生產；批號：220930規(guī)格：1.25L/瓶；

2）秋水仙素，上海谷研科技有限公司生產；CAS號：64-86-8 規(guī)格：25g/瓶；

3）卡諾固定液，上海君瑞生物科技有限公司；貨號：JR00936 規(guī)格：100M；

4）混和酸(45%醋酸,1mol 鹽酸，l%硫酸銨100,10:1 混和)；

5）70%和95%的酒精；

6）75%的乙醇。

1.3 實驗儀器

普通光學顯微鏡 拓豐儀器科技(上海）有限公司

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)基配制

2.1.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

分化培養(yǎng)基:2 mg·L-1細胞分裂素(6-BA)+MS+7g·L-1瓊脂+0.2 mg·L-1生長素（IAA）+3%蔗糖;誘導愈傷培養(yǎng)基:2mg·L-1細胞分裂素（6-BA）+MS+0.2mg·L-1生長素2,4-D+7 g·L-1瓊脂+3%蔗糖;生根培養(yǎng)基:0.2 mg·L-1生根粉ABT+1/2MS+7g·L-1瓊脂+2%蔗糖。培養(yǎng)條件是在25℃左右。

2.2 秋水仙素配制方法

將秋水仙素直接放在冷水中進行溶解，或者先把它放在少量的酒精中進行溶解，然后加入冷水。配制好的溶液應放在棕色玻璃瓶中進行貯存，并且把瓶子放在暗處，避免陽光直射，此外瓶蓋應擰緊，以減少與空氣的接觸，防止藥效揮發(fā)。

2.3 檢測方法

丹參的多倍體形成完整植株后，切去0.5 cm 的根尖,采用文獻[9]的方法對根尖進行染色體鑒定。起初將切好的根尖用蒸餾水清洗3 次,放進0.1%秋水仙堿溶液中處理1.5 h,取出后用蒸餾水再洗3 次,放進卡諾固定液中固定2 h,然后分別用95%與70%乙醇、蒸餾水各洗3次,再用混和酸(45%醋酸、1mol/L 鹽酸、l%硫酸按100:10:1 混和)在室溫下離析80min,最后水洗3 次,放入70%乙醇中保存，最后進行鏡檢。

2.4 多倍體誘導

開始誘導丹參多倍體,通過三種方法從秋水仙素劑量、處理方法和處理時間三個方面來對比研究觀察。

2.4.1 幼苗處理法

將濃度為30,40,50mg/L 的秋水仙素過濾滅菌后加入分化培養(yǎng)基,將長1.5～2cm 丹參幼苗轉入該培養(yǎng)基中,分別料理5,7,10d,各3 次重復,每組處理50 株。移到生根培養(yǎng)基之后,開始1 周轉繼1 次,轉2 次后間隔的時間可加長。

2.4.2 葉片處理法

參照文獻[10]等的培養(yǎng)方法,將帶柄的丹參幼葉切成0.2cm2的小塊接種于分化培養(yǎng)基預培養(yǎng)1 周后，分別轉入加有不同含量(5,10,15,20 mg·L-1)秋水仙素的分化培養(yǎng)基中處理1 周或2 周后，再轉入無秋水仙素的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，各設3 次重復，每次處理50 個切塊。

2.4.3 愈傷組織處理法

將帶柄丹參幼葉切成0.2cm2的小塊接種于誘導培養(yǎng)基上，當愈傷組織長出后切割成4～5mm2大小轉入加有5,10,15,20mg/L 秋水仙素的分化培養(yǎng)基中1 周或2 周處理后，然后轉移到沒有加秋水仙素的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，各設3 次重復，每處理50 個切塊。

3 結果與分析

表1 秋水仙素在不同濃度時處理丹參幼苗的加倍效果

實驗結果表明：在幼苗處理法中,多倍體出現(xiàn)的頻率并不隨含量的增加和處理時間的增加而增加。但是秋水仙堿的劑量和處理時間對幼苗加倍率有著非常大的影響。其中40 mg/L 秋水仙堿處理5 d 的效果最明顯,幼苗加倍率12%。

實驗結果表明：秋水仙堿的培養(yǎng)基中處理1～2 周,都有利于多倍體的生成,處理時間對加倍率沒有明顯規(guī)律影響；不同劑量存在非常明顯的差異，隨著秋水仙堿劑量的增加而增加,但當增加到一定劑量時,誘變率反而降低,從產生多倍體頻率來看15 mg/L 處理1 周的效果最好,加倍率最高達34.13%。

表2 秋水仙素在不同濃度時處理丹參葉片的加倍效果

表3 秋水仙素在不同濃度時處理丹參愈傷組織的加倍效果

實驗結果表明：15 mg/L 處理1 周的效果最好,加倍率最高達33.23%.但由于需首先誘導出愈傷組織再進行分化，所需時間較葉片法長(表3)。誘導丹參多倍體的3 種方法中頻率隨外植體、處理時間、秋水仙素劑量的不同誘導效果均有不同。處理時間越短、秋水仙素劑量越低、分化率雖高,但加倍率低；處理時間越長，秋水仙素劑量越高、外植體成活率越低，分化率及加倍率亦隨之降低。因此要得到較高的加倍率和保持較高的成活率,選擇合適的外植體、處理時間和秋水仙素劑量是非常重要的。

4 討論

利用秋水仙素誘導多倍體育種，方便、經濟、專一性強。秋水仙素實際上是一種抑制劑，其主要作用機理是抑制紡錘體的形成，使染色體不能移向兩極，從而實現(xiàn)體內染色體的加倍，得到多倍體的植物。但對于不同的外植體,誘導效果不同。實驗證明,要想得到最好的誘導方法應該把處理時間和秋水仙素的劑量組合起來,篩選出最佳處理時間和秋水仙素劑量；本實驗中將秋水仙素加入培養(yǎng)基中采用幼苗、葉片和愈傷組織三種不同的外植體進行誘導。得出結論，用15 mg/L 秋水仙素處理1 周的葉片和愈傷組織誘導效果最好，可達34.13%和33.23%，而對幼苗的誘導最高只有12%左右，說明早期誘導比成苗后誘導效果好。在愈傷組織處理法中由于需首先誘導出愈傷組織再進行誘導分化，所以所需時間比葉片處理法長，最終表明葉片處理法加入15 mg/L 秋水仙素處理1 周誘導的多倍體效果最好。

［1］中國醫(yī)學科學院藥物研究所,等.中藥志(第一冊) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1979：339－349.

［2］黃韌敏,袁淑蘭,宋琦，等.丹參酮誘導HL -60 細胞分化及凋亡的流式細胞術分析[J].中國腫瘤臨床,1997,24(7):500－500.

［3］房其年,張佩玲,徐宗沛.丹參抗菌有效成分的研究[J].化學學報,1976,34(3):197－208.

［4］張愛民,常莉,薛建平.藥用植物多倍體研究進展[J].中國中藥雜志，2005,30(9):645－645.

［5］石蔭坪.棗胚乳三倍體的育成及生物學細胞研究[J].山東果樹,1985,(1):1-3.

［6］陳柏君,高山林,卞云云.黃芩組織培養(yǎng)同源四倍體的誘導[J].植物資源與環(huán)境學報,2000,9(1):9-11.

［7］陳素萍,王莉,宋秀清.黨參多倍體育種的研究[J].中草藥,1991,22(5):224-227.