王 津， 周志江， 韓 燁， 陳 穎， 范 寰

（1.天津大學化工學院，天津南開 300072；2.天津市林業(yè)果樹研究所，天津西青 300384；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津西青 300384）

益生元是指能使腸道中有益菌活化的物質，它不能被宿主消化吸收卻能選擇性地促進腸道中有益菌的生長、繁殖，主要包括低聚糖、多糖、天然植物提取物、蛋白水解物、多元醇等（Mookiah等，2014；于曉燕和朱京慈，2008）。 目前飼料中添加的主要是低聚糖類益生元。在實踐應用中低聚糖與益生素配合使用，促進益生菌在腸道的增殖及定植，抑制腸道腐敗菌的生長（Liong和Shah，2005）。本試驗探討低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼寡糖、異麥芽糖和甘露寡糖等對乳酸片球菌體外增殖和抑菌效果影響，為乳酸片球菌與低聚糖配伍使用提供一定的理論科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）PA003由天津大學食品科學系食品生物技術實驗室保存；單核細胞增多癥李氏桿菌（Lister monocytogenes）CVCC1591，購于中國獸藥監(jiān)察中心。

1.2 低聚糖 低聚木糖含量 （以干物質計）≥90%；低聚果糖含量（以干物質計）≥95%；低聚半乳糖含量（以干物質計）≥95%；殼寡糖含量（以干物質計）≥95%；異麥芽糖含量 （以干物質計）≥90%；甘露寡糖含量（以干物質計）≥90%。以上低聚糖均為市購。

1.3 培養(yǎng)基 MRS基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，酵母提取物 0.5 g，胰蛋白胨1 g，牛肉膏1 g，磷酸氫二鉀0.2 g，乙酸鈉0.5 g，檸檬酸銨0.2 g，硫酸鎂0.058 g，硫酸錳 0.025 g，吐溫-80 0.1 g，水 100 mL，pH 6.5。

試驗培養(yǎng)基：分別以低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼寡糖、異麥芽糖和甘露寡糖取代基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源配制而成，其他成分同基礎培養(yǎng)基。

TSYEB培養(yǎng)基：葡萄糖0.25 g，胰蛋白胨1.7 g，酵母提取物0.6 g，大豆蛋白胨0.3 g，氯化鈉0.5 g，磷酸氫二鉀 0.25 g，水 100 mL，pH 7.1 ～ 7.5。

1.4 菌株活化 將乳酸片球菌PA003以0.1%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。使用平板計數(shù)細菌的濃度，調整其濃度為109cfu/mL，備用。抑菌試驗指示菌為單核細胞增多癥李氏桿菌，以1%接種于TSYEB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。使用平板計數(shù)細菌的濃度，調整其濃度為109cfu/mL，備用。

1.5 不同種類低聚糖對乳酸片球菌增殖的影響分別以2%（m/V）的低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、殼寡糖、異麥芽糖和甘露寡糖取代基礎培養(yǎng)基的葡萄糖為處理組，葡萄糖培養(yǎng)基為對照組，采用平板計數(shù)法考察不同種類低聚糖對乳酸片球菌增殖的影響。將活化后的乳酸片球菌菌懸液，按10倍梯度稀釋法稀釋，選擇合適的稀釋度，涂布接種于預先傾注好的MRS基礎培養(yǎng)基及試驗培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。取出各平板，觀察菌落生長情況，分別計數(shù)各稀釋度平板表面生長的菌落數(shù)，以菌落數(shù)為50～300的平板為統(tǒng)計對象，計算乳酸片球菌增殖的菌落數(shù)（cfu/mL），每個處理設3個重復。

1.6 不同種類低聚糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響 分別以2%（m/V）的低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、異麥芽糖和甘露寡糖取代基礎培養(yǎng)基的葡萄糖為處理組，葡萄糖培養(yǎng)基為對照組，采用牛津杯法測定不同種類低聚糖對乳酸片球菌抑菌效果（丁成為等，2007）。將活化后的乳酸片球菌發(fā)酵液以1%接種量接種于MRS液體基礎培養(yǎng)基及試驗培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。單核細胞增多癥李氏桿菌作為指示菌，測量抑菌圈直徑，每個處理設3個重復。

1.7 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌增殖的影響 分別以0.5%、1%、2%、3%、4%（m/V）的低聚果糖取代基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖作為試驗培養(yǎng)基。采用平板計數(shù)法考察不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌增殖的影響。將活化后的乳酸片球菌菌懸液，按10倍梯度稀釋法稀釋，選擇合適的稀釋度，涂布接種于預先傾注好的試驗培養(yǎng)基平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。菌落計數(shù)方法同1.5。

1.8 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響 分別以 0.5%、1%、2%、3%、4%（m/V）的低聚果糖取代葡萄糖添加到基礎培養(yǎng)基中。采用牛津杯法測定不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌抑菌效果。將活化后的乳酸片球菌發(fā)酵液以1%接種量接種于不同濃度低聚果糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。單核細胞增多癥李氏桿菌作為指示菌，測量抑菌圈直徑，每個處理設3個重復。

1.9 乳酸片球菌生長曲線的測定 以2%（m/V）的低聚果糖取代基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖作為試驗培養(yǎng)基，葡萄糖培養(yǎng)基為對照組。將活化后的乳酸片球菌發(fā)酵液以1%接種量接種于基礎培養(yǎng)基和試驗培養(yǎng)基。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測定其吸光度值，吸光度測定波長為600 nm。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 不同種類低聚糖對乳酸片球菌增殖的影響不同種類低聚糖在相同的添加量下對乳酸片球菌增殖的影響結果見表1。由表1可知，不同種類低聚糖對乳酸片球菌的增殖影響效果不同。乳酸片球菌基本上不能利用殼寡糖。與對照組相比，低聚果糖和低聚半乳糖均促進了乳酸片球菌的增殖。低聚果糖能被乳酸片球菌選擇性發(fā)酵，發(fā)酵后的菌體濃度可達到（3.08±0.54）×109cfu/mL，約是葡萄糖對照組的1.38倍，差異顯著（P＜0.05）。低聚半乳糖也能促進乳酸片球菌生長，但是與葡萄糖對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同種類低聚糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響 不同種類低聚糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響結果見表2。由表2可知，不同種類低聚糖發(fā)酵乳酸片球菌對單核細胞增多癥李氏桿菌均有一定的抑制作用，抑菌圈直徑為10.08～14.21 mm。與葡萄糖對照組相比，低聚果糖能明顯增加乳酸片球菌抑菌性，抑菌圈直徑達到14.21 mm（P＜0.05）；而低聚半乳糖作為碳源，對乳酸片球菌本身抑菌特性無明顯影響（P＞0.05）。

表1 不同種類低聚糖對乳酸片球菌增殖的影響 cfu/mL

表2 不同種類低聚糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響 mm

2.3 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌增殖的影響 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌增殖的影響結果見表3。由表3可知，低聚果糖濃度在0.5%～2%，隨著低聚果糖濃度的升高，乳酸片球菌菌落數(shù)相應升高。此外，培養(yǎng)基中低聚果糖的含量并不是越高越好，以2%濃度的增殖效果最好，乳酸片球菌菌落數(shù)達到最大。而低聚果糖濃度達到3%時，乳酸片球菌菌落數(shù)反而下降。當?shù)途酃菨舛冗_到4%時，菌落數(shù)已經降至（0.33±0.19）×109cfu/mL。這可能是由于低聚果糖濃度過高形成高滲透壓環(huán)境，菌體細胞脫水，從而抑制菌體生長。因此，2%濃度的低聚果糖為乳酸片球菌增殖的最佳濃度。

2.4 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響結果見表4。由表4可知，低聚果糖濃度在0.5%～2%，隨著低聚果糖濃度的升高，抑菌圈直徑相應變大。而低聚果糖濃度達到3%時，抑菌圈直徑反而略有下降。當?shù)途酃菨舛冗_到4%時，抑菌圈直徑明顯變小，說明，乳酸片球菌的抑菌特性受到嚴重抑制。這可能是由于高滲透壓的低聚果糖對細菌的脫水作用，抑制了乳酸片球菌的生長，導致乳酸片球菌菌素和乳酸生成明顯減少（王晶等，2013）。因此，低聚果糖濃度為2%時，乳酸片球菌達到最大抑菌活性。

表3 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌增殖的影響

表4 不同濃度低聚果糖對乳酸片球菌抑菌效果的影響

2.5 乳酸片球菌生長曲線的建立 乳酸片球菌液體培養(yǎng)后的生長曲線見圖1。由圖1可知，在0～24 h，與葡萄糖相比，低聚果糖作為碳源，乳酸片球菌能迅速進入對數(shù)生長期，適應期有所縮短。培養(yǎng)12 h后達到生長穩(wěn)定期，低聚果糖組的OD值也略高于葡萄糖組。因此低聚果糖對乳酸片球菌體外生長有顯著促進作用，優(yōu)于葡萄糖作碳源時的生長效果。

圖1 乳酸片球菌生長曲線

3 討論

微生物的生長可用比濁法、直接涂布法、傾注培養(yǎng)和OD值等多種方法進行測定，本試驗采用直接涂布法測定菌落形成單位（cfu/mL）。雖然比較繁瑣，但因低聚木糖、殼寡糖溶解性不好，會有輕微的渾濁現(xiàn)象，因此比濁法和OD值的方法都會影響測定的可靠性，因此選用直接涂布法進行細菌生長的測定。

低聚糖由于其分子間結合位置及結合類型特殊，飼喂后不能被單胃動物自身分泌的消化酶分解。單胃動物消化道寄生著大量微生物，這些微生物具有切斷低聚糖末端糖苷鍵的酶，因此低聚糖可被有益微生物利用。低聚糖可選擇性促進腸道有益菌繁殖，發(fā)酵后產生乳酸、乙酸、短鏈脂肪酸等酸性物質。乳酸可直接作為營養(yǎng)物質被機體吸收，還可作為殺菌劑抑制腸道中病原菌的增殖；短鏈脂肪酸可通過降低腸道pH值，抑制病原菌的生長繁殖，同時通過降低腸道氧化還原電位，調節(jié)腸道蠕動，間接阻止病原菌在腸道上皮細胞的粘附定殖。低聚糖與腸上皮寡糖結構受體相似，可與病原菌的外源凝集素特異性結合，使病原菌不能在腸道上粘附，而隨低聚糖通過消化道排出體外（武香玉等，2013）。

低聚果糖具有調節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌和乳桿菌的作用 （項明潔等，2005）。有研究報道，低聚果糖能防止早期斷奶犢牛腸道萎縮，維持腸道正常形態(tài)結構，提高犢牛免疫性能（邰秀林等，2009）。低聚果糖能促進乳桿菌和雙歧桿菌的增殖并抑制腸桿菌和腸球菌的增殖 （杭鋒等，2009）。本試驗也得到類似結果，低聚果糖可促進乳酸片球菌的增殖，并對單核細胞增多癥李氏桿菌有很好的抑菌活性。因此本試驗結果為制備復合型動物微生態(tài)制劑-合生元提供了理論和科學依據。

4 結論

低聚果糖對乳酸片球菌體外生長具有顯著促進作用。培養(yǎng)基中低聚果糖添加比例為2%時，能明顯促進乳酸片球菌生長，發(fā)酵后的菌體濃度可達到（3.08±0.54）×109cfu/mL；同時也能明顯提高乳酸片球菌抑菌性，抑菌圈直徑達到（14.21±0.30）mm。 與葡萄糖相比，低聚果糖作為碳源，乳酸片球菌能迅速進入對數(shù)生長期，適應期有所縮短。

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