李建欣，代西梅，張佳佳，張永山

（1.鄭州大學(xué) 離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 鄭州 450052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南 鄭州 455000）

棉花是我國(guó)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于雜交育種的需要，對(duì)它的胚胎學(xué)曾進(jìn)行過許多的研究工作。有關(guān)胚囊方面，國(guó)內(nèi)外都有過一些報(bào)道［1-4］。從60年代初開始，對(duì)棉花受精作用的形態(tài)學(xué)，曾進(jìn)行一系列的研究，推進(jìn)了對(duì)受精過程的微觀現(xiàn)象的了解，其中以光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察為主，也有部分超微結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道，采用石蠟切片的掃描電鏡觀察技術(shù)雖然可以觀察到胚囊的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)，但是這種方法操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作要求較高［5］。

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）可以對(duì)活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的系列光學(xué)切片，得到其各層面的信息。這種功能也被形象地稱為“顯微CT”。此外，利用激光掃描共聚焦顯微鏡還可以對(duì)樣品材料進(jìn)行連續(xù)掃描，通過電腦處理從而獲得其三維立體結(jié)構(gòu)，對(duì)其樣品內(nèi)各細(xì)胞的空間分布有更清晰的認(rèn)識(shí)［6-8］。利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察水稻等植物的胚囊結(jié)構(gòu)、形成及發(fā)育過程等方面的研究已有一些報(bào)道［9-12］。

但目前尚未見到利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察棉花胚囊結(jié)構(gòu)的報(bào)道。因?yàn)槊藁ǖ呐咧檩^大，熒光染色觀察比較困難。本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)棉花胚囊結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，把非同一焦平面的圖像用連續(xù)掃描技術(shù)合成到一張圖像中。該方法制片簡(jiǎn)單，方便操作，獲得了清晰的圖片及大量資料，為棉花胚囊結(jié)構(gòu)的研究提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料是普通棉花品種，在開花前和授粉后分別取棉花的胚珠于FAA溶液中固定48h。

1.2 方法

（1）取胚囊：將已在FAA溶液中固定的棉花胚珠放入70%酒精與濃鹽酸的比例為3∶1的溶液中清洗3～5min，然后放在解剖鏡下將內(nèi)外珠被剝掉，取出胚囊（這一步非常關(guān)鍵，需要一個(gè)熟練的過程，否則很容易在剝離內(nèi)外珠被時(shí)弄破胚囊）在42℃水浴鍋中處理2.5h。

（2）復(fù)水：棉花胚囊經(jīng)50%、30%、15%梯度酒精再到蒸餾水中，每級(jí)20min。

（3）水解：棉花胚囊在1mol／L NaOH 下水解8 h，蒸餾水徹底洗凈。

（4）襯染：加入1%的曙紅Y染色8h，吸去染色液，用蒸餾水清洗，換液數(shù)次至水中無浮色。

（5）緩沖液：加入pH＝5的檸檬酸-磷酸緩沖液處理8h。

（6）熒光染色：用5mg／L的熒光染料DAPI水溶液，在25℃暗室中染色24h。

（7）脫水：棉花胚囊從15%酒精中依次轉(zhuǎn)入30%、50%、70%、80%、95%、100%濃度梯度的酒精中各脫水20min，在100%酒精中再脫水3次，每次2h，最后1次12h。

（8）透明處理：棉花胚囊從100%酒精轉(zhuǎn)入水楊酸甲酯和無水酒精的等量混合液中約1h后，轉(zhuǎn)入水楊酸甲酯中，2次，每次3h，最后1次15h以上，經(jīng)過透明處理的材料仍可保存于水楊酸甲酯中。

（9）制片觀察：將透明棉花胚囊置于滴有丁香油的凹形載玻片上，蓋上蓋玻片，在Leica SP2激光掃描共聚焦顯微鏡上用488nm激光激發(fā)觀察并攝像。

2 結(jié)果分析

2.1 成熟的胚囊、極核和卵細(xì)胞

激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到的棉花胚囊內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)見圖1。棉花成熟胚囊內(nèi)珠孔端由2個(gè)助細(xì)胞、1個(gè)卵細(xì)胞和1個(gè)中央細(xì)胞共同構(gòu)成雌性生殖單位（見圖中1）。在受精前，其中的1個(gè)助細(xì)胞退化，在成熟胚囊珠孔端，能見到1個(gè)助細(xì)胞、1個(gè)卵細(xì)胞和1個(gè)中央細(xì)胞（見圖中2）。中央細(xì)胞為1個(gè)高度液泡化的細(xì)胞，2個(gè)極核緊靠在一起，各有1個(gè)較大的核仁（見圖中3）。

圖1 激光共聚焦觀察棉花胚囊內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)

2.2 精核與卵核的融合

開花后花粉粒在柱頭上萌發(fā)，形成花粉管。花粉管形成后，進(jìn)入胚囊，花粉管在退化助細(xì)胞的位置釋放出2個(gè)精子以及其他一些內(nèi)含物。2個(gè)精核分別進(jìn)入極核與卵細(xì)胞（見圖1中4）。進(jìn)入卵細(xì)胞的精核慢慢移動(dòng)到卵核的位置，然后精核的內(nèi)容物慢慢進(jìn)入卵細(xì)胞核，隨后在卵核內(nèi)出現(xiàn)1個(gè)雄性核仁，然后雌性核仁與雄性核仁融合。至此，卵細(xì)胞與精子的融合完成而形成1個(gè)合子。

2.3 精核與極核的融合

精核與極核的融合過程類似于精核與卵核的融后過程。在觀察過程中發(fā)現(xiàn)，大部分精核是與1個(gè)極核融合后再與另1個(gè)極核發(fā)生融合的，偶爾可見到精核與次生核的融合。在開花后，可觀察到精核首先與1個(gè)極核的核膜接觸，進(jìn)行核膜的融合（見圖1中5））；隨后精核的染色質(zhì)向極核內(nèi)分散；再后在極核內(nèi)出現(xiàn)1個(gè)小的雄性核仁，雄性核仁會(huì)慢慢變大；最后增大至與極核的核仁差不多大小。1個(gè)精核與極核完成融合，形成初生胚乳核。精子與極核融合后很快進(jìn)行分裂，行成初生胚乳核（見圖1中6）。

3 討論

棉花胚囊的觀察有很重要的實(shí)際價(jià)值，例如棉花中一些不育的胚珠稱為“籽屑”。籽屑對(duì)于紡織工業(yè)是個(gè)不利的因素。如果棉花中籽屑比例過高，便嚴(yán)重地影響紡紗質(zhì)量。籽屑大致可以分為三類：（1）胚珠中不形成胚囊；（2）胚珠中有正常的胚囊，但沒有受精；（3）胚珠中受精了，但是胚胎發(fā)育受到了抑制。因此，從胚囊的觀察圖片上可區(qū)別出受精的和不受精的籽屑。棉花的胚胎發(fā)育還有很多畸形的現(xiàn)象，其影響了棉纖維的正常發(fā)育。有時(shí)，由于某種原因，導(dǎo)致一部分正在發(fā)育的胚胎敗育，致使棉纖維發(fā)育不良，降低纖維的質(zhì)量，即所謂不成熟籽（或癟籽）的劣纖維。研究籽屑的成因和引起胚胎敗育的原因，采取人為措施，減少籽屑的產(chǎn)生及克服胚胎敗育，對(duì)于提高棉纖維的質(zhì)量具有重要的意義［13］。

棉花胚囊經(jīng)熒光染色及透明處理后，通過LSCM可清晰地觀察到胚囊內(nèi)各細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核及核仁經(jīng)激光激發(fā)后可以顯示較強(qiáng)的熒光，通過LSCM的激光掃描系統(tǒng)可以清晰地觀察到胚囊內(nèi)各細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及空間分布情況。由于棉花胚囊在成熟期較大，在觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)胚囊內(nèi)各細(xì)胞不一定在同一個(gè)光學(xué)切面上，此時(shí)可利用LSCM系列掃描功能進(jìn)行逐層掃描。LSCM的這種功能可以使我們更準(zhǔn)確地觀察組織內(nèi)不同層面的結(jié)構(gòu)，并免去石蠟切片、超薄切片等繁瑣的制片工作。系列掃描圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)三維重建后，可得到樣品的三維重建結(jié)構(gòu)，三維重建后的圖像可沿X、Y、Z軸進(jìn)行任意角度的旋轉(zhuǎn)，可從不同的角度觀察樣品內(nèi)的結(jié)構(gòu)及空間關(guān)系［14］。利用LSCM的這種連續(xù)掃描及重建功能同樣也可以清晰地觀察到棉花成熟胚囊內(nèi)及雙受精過程中各細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其空間分布關(guān)系。

研究棉花成熟胚囊的結(jié)構(gòu)，對(duì)胚囊結(jié)構(gòu)各部分的超微結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核的核膜、核仁中的核仁絲、液泡膜、液泡中的內(nèi)含物以及胚囊壁內(nèi)突等的觀察，幾乎全部用石蠟切片掃描電鏡的技術(shù)，但是材料的立體感不強(qiáng)，制片方法復(fù)雜，限制了研究者快速制片觀察以及更大范圍的應(yīng)用。

利用LSCM觀察胚囊的關(guān)鍵問題是胚囊的剝離以及之后的水解和熒光染色的時(shí)間。由于棉花胚珠相對(duì)較大，所以在進(jìn)行染色之前要在解剖鏡下把胚珠的內(nèi)外珠被剝掉，只剩胚囊，對(duì)一個(gè)胚囊進(jìn)行整體染色就比較容易，而在之后的水解階段由于棉花的細(xì)胞壁會(huì)阻礙熒光染料的進(jìn)入，所以用NaOH處理的時(shí)間要合適，時(shí)間既不能太久否則會(huì)使細(xì)胞變形，時(shí)間也不能太短否則熒光染料不容易進(jìn)入胚囊。熒光染料DAPI作用時(shí)間也需要合適，否則會(huì)看不清或者胚囊全部染色而導(dǎo)致無法清晰地觀察到細(xì)胞［15］。雖然此法不能像在透射電鏡下分辨細(xì)胞中的一些小細(xì)胞器，而且胚囊的超微結(jié)構(gòu)觀察與前人的結(jié)果相似，但它的整體感強(qiáng)，制片方法簡(jiǎn)便。而這種快捷的方法有著更深遠(yuǎn)的價(jià)值。不僅可以應(yīng)用在觀察棉花不育過程中染色體等的變化和棉纖維的發(fā)育，還可以用來觀察棉花胚囊內(nèi)細(xì)胞骨架和Ca2＋ 的變化和分布［16］。所以接下來的研究工作是利用此種技術(shù)在棉花細(xì)胞學(xué)的層面上對(duì)棉花進(jìn)行更深入的研究。

（

）

［1］焦改麗，孟釗紅，楊曉黎，等.光學(xué)顯微及掃描電鏡冷臺(tái)觀察陸地棉胚胎發(fā)育［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：1180-1182，1196

［2］張寶紅，劉方，姚長(zhǎng)兵，等.棉花組織培養(yǎng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的掃描電鏡觀察［J］.作物學(xué)報(bào)，2000，26（1）：125-130.

［4］李正里，胡紹安.棉花胚胎學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)（一）［J］.中國(guó)棉花，1978，2（3）：40-44.

［5］李正里，胡紹安.棉花胚胎學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)（二）［J］.中國(guó)棉花，1978，2（4）：32-34.

［6］田克斌，韓麗林，江銀華，等.激光共聚焦顯微重建鮮紅斑痣三維結(jié)構(gòu)的初步研究［J］.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，41（5）：491-493.

［7］Smithies D J，van Gemert M J，Hansen M K，et al.Three-dimensional reconstruction of port wine stain vascular anatomy from serial histological sections［J］.Phys Med Biol，1997，42（9）：1843-1847.

［8］Zhang W H，Zhu S N，Lu S L，et al.Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope［J］.World J Gastroenterol，2000，6（3）：344-347.

［9］代西梅，黃群策，秦廣雍.水稻雙受精過程的共聚焦顯微鏡觀察［J］.廣西植物，2008，28（1）：15-19.

［10］張佳佳，代西梅，趙帥鵬，等.激光掃描共聚焦顯微技術(shù)對(duì)水稻不育系花粉減數(shù)分裂的特性研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2013，33（9）：2483-2487.

［11］Terada S.Embryological studies in Oryza sativa L［J］.J Coll Agrie Hokkaido Imp Univ，1928，19：245-260.

［12］Cho J.Double fertilization in Oryza sativa L and devolopment of the endosperm with special reference to the aleuron layer［J］.Bull Nat Inst Sei Ser D，1956（6）：61-101.

［13］萬濤，盧潔，平美廣.植物胚胎敗育原因的解剖學(xué)研究進(jìn)展［J］.景德鎮(zhèn)高專學(xué)報(bào)，2007，22（4）：11-12，17.

［14］楊子賢，王洪星，易小平.激光掃描共聚焦顯微鏡在生物科學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.熱帶生物學(xué)報(bào)，2013，4（1）：99-104.

［15］代西梅，黃群策，李國(guó)平，等.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察水稻雙受精過程［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：25-30.

［16］肖光輝，梅文倩，朱玉賢.棉纖維細(xì)胞發(fā)育過程中鈣離子內(nèi)流和鈣依賴蛋白激酶活性的動(dòng)態(tài)變化［J］.中國(guó)科學(xué)，2013，43（10）：886-896.