孫 晶， 曹 玲， 馮有龍， 譚 力

（江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京210008）

中成藥及保健食品中化學(xué)藥物的非法添加現(xiàn)象呈逐年上升趨勢(shì)，其中補(bǔ)腎壯陽類中成藥和保健食品一直以來都是非法添加的重災(zāi)區(qū)，添加物是以西地那非和他達(dá)拉非為代表的5 型磷酸二酯酶（phosphodiesterase-5，PDE-5）抑制劑［1］。該類藥物的突出特點(diǎn)就是衍生物數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)相似［2］（如表1所示）、活性相近且合成簡(jiǎn)單，但衍生物的對(duì)照品卻相對(duì)難得。盡管最新的國(guó)家藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法（批準(zhǔn)件編號(hào)為2009030）中檢測(cè)的PDE-5 抑制劑數(shù)目已達(dá)11 種，但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中卻不斷有該類化合物新衍生物的非法添加報(bào)道，數(shù)目已不下40 種［3，4］；并且標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中11 種對(duì)照品價(jià)格十分昂貴，其他PDE-5 抑制劑衍生物的對(duì)照品更不易獲得，監(jiān)控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

表1 PDE-5 抑制劑的分類、結(jié)構(gòu)式和典型共有碎片離子Table 1 Types，formulae and typical common product ions of PDE-5 inhibitors

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS／MS）具有高通量、靈敏、專屬等特點(diǎn)，是目前從成分、基質(zhì)復(fù)雜的中藥保健食品中篩選和仲裁非法添加物的最有效方法［3］。按照質(zhì)量分析器劃分，質(zhì)譜可分為三重四極桿質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜（如飛行時(shí)間質(zhì)譜）。對(duì)于檢測(cè)新的PDE-5 抑制劑衍生物，目前文獻(xiàn)中常用的LC-MS／MS 掃描模式存在一定的局限性:三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式［5］靈敏度高，適合定量［6］，但由于限定母／子離子對(duì)，對(duì)設(shè)定的目標(biāo)化合物以外的物質(zhì)均“不可見”，未知衍生物因此被忽略；三重四極桿或離子阱質(zhì)譜全掃描模式［7］信息量大，但是非法添加物和樣品基質(zhì)中的天然組分不易區(qū)分，篩選未知的非法添加物對(duì)操作者的質(zhì)譜解析能力要求高，且需要時(shí)間和精力，故往往事倍功半；數(shù)據(jù)庫(kù)軟件篩查源于全掃描模式代替人工查閱數(shù)據(jù)，節(jié)省時(shí)間，但判定參數(shù)的設(shè)置對(duì)結(jié)果影響較大，且該法需要建立標(biāo)準(zhǔn)圖庫(kù)［8，9］，對(duì)超出檢測(cè)名單的新型衍生物的發(fā)現(xiàn)和鑒定能力有限［3］；高分辨質(zhì)譜具有高分辨率，專屬性大大提高，已有許多成功應(yīng)用案例［8，9］，但是儀器價(jià)格昂貴，制約其推廣。

三重四極桿掃描模式除常用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式外，還有中性丟失掃描（neutral loss scanning）和前體離子掃描（precursor ion scanning，或稱為母離子掃描（parent ion scanning））模式，兩者都是篩選未知化合物的有力手段，其中前體離子掃描尤其適合篩選結(jié)構(gòu)相似的化合物，如同系物；而非法添加的新趨勢(shì)是添加已知療效藥物的衍生物，正具有結(jié)構(gòu)相似這一特點(diǎn)。本文把易被忽視的三重四極桿前體離子掃描（或母離子掃描）功能［10］應(yīng)用于PDE-5 抑制劑的快速篩查中，是非法添加檢測(cè)的一種新的嘗試，國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究通過三重四極桿質(zhì)譜的多種掃描功能（全掃描、子離子掃描）分析PDE-5 抑制劑的質(zhì)譜特點(diǎn)，尋找共有結(jié)構(gòu)碎片，將其分為5 類:紅地那非類、拉非類、西地那非類、伐地那非類和硫代那非類（見表1），建立了前體離子掃描模式測(cè)定補(bǔ)腎壯陽類中成藥及保健食品中PDE-5 抑制劑的方法，并對(duì)重要參數(shù)加以討論。經(jīng)過實(shí)際樣品測(cè)定驗(yàn)證，該方法既能滿足日常檢驗(yàn)對(duì)已知非法添加物的檢測(cè)需要，又可篩選出疑似的未知PDE-5 抑制劑的衍生物，為進(jìn)一步研究鑒定提供方向，大幅提高未知衍生物的檢測(cè)鑒定效率，也為檢測(cè)未知的非法添加物提供了新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo uHPLC／TSQ Quantum Access 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Millipore Milli-Q Gradient A10 純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

枸櫞酸西地那非（Sildenafil citrate）、他達(dá)拉非（Tadalafil）對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供；那紅地那非（Noracetildenafil）、紅地那非（Acetildenafil）、氨基他達(dá)拉非（Aminotadalafil）、羥基豪莫西地那非（Hydroxyhomosildenafil）、伐地那非二鹽酸鹽（Vardenafil dihydrochloride）、豪莫西地那非（Homosildenafil）、偽伐地那非（Pseudovardenafil）、硫代艾地那非（Thioaidildenafil）、那莫西地那非（Norneosildenafil）均購(gòu)于加拿大Toronto Research Chemicals 公司，純度大于99%。甲醇、乙腈、醋酸銨、冰醋酸均為色譜純。純水由Milli-Q 超純水儀制備。樣品:中成藥和保健品均為國(guó)家抽樣樣品。所有試劑和樣品均需過0.22 μm 濾膜。

1.2 溶液制備

混合對(duì)照品儲(chǔ)備液:分別精密稱取氨基他達(dá)拉非和他達(dá)拉非對(duì)照品各5 mg，其他對(duì)照品各1 mg，置于同一10 mL 容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度作為混合對(duì)照儲(chǔ)備液。臨使用前用50%（v／v）乙腈稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化溶液:分別稱取各對(duì)照品，以初始流動(dòng)相溶解，并稀釋成最終約為5 mg／L 的溶液。

1.3 樣品前處理方法

丸劑和膠囊等固體制劑:取多粒研細(xì)，混勻，精密稱取一次服用量，置于50 mL 量瓶中，加入乙腈約40 mL，超聲處理15 min，冷卻至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，過濾；精密量取續(xù)濾液5 mL，置于10 mL 量瓶中，用50%（v／v）乙腈稀釋至刻度。

1.4 液相色譜條件

色譜柱:Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent 公司）；柱溫:40℃；流動(dòng)相A:20 mmol／L 醋酸銨溶液（含0.1%（v／v）醋酸）；流動(dòng)相B:甲醇-乙腈（25∶15，v／v）；線性梯度洗脫程序:0 ～8.0 min，40% B ～95% B；8.0 ～10.0 min，95% B；10.0 ～10.5 min，95% B ～40%B；10.5 ～13.0 min，40%B。流速:0.3 mL／min；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧離子化正離子模式；毛細(xì)管電壓:4 kV；錐孔電壓:35 V；離子源溫度:350 ℃；霧化氣壓力:241 kPa；輔助氣壓力:5 arb；氬氣碰撞壓力:0.2 Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 前體離子掃描模式的建立和優(yōu)化

2.1.1 PDE-5 型抑制劑的分類和子離子研究

根據(jù)結(jié)構(gòu)特征將PDE-5 型抑制劑分為5 類，以最常見的紅地那非、他達(dá)拉非、西地那非、伐地那非和硫代艾地那非，分別作為紅地那非類、拉非類、西地那非類、伐地那非類和硫代西地那非類的代表化合物進(jìn)行二級(jí)子離子的掃描，解析代表化合物的碎片離子，尋找可能的具有母核信息的碎片，并優(yōu)化這些碎片的二級(jí)碰撞能量（CID），拉非類的CID 為15～20 eV，其他的CID 為35 ～40 eV。

結(jié)合準(zhǔn)確質(zhì)量和結(jié)構(gòu)通式，各類共有碎片的推斷結(jié)果如表1 所示。紅地那非類共有子離子有m／z 353.160 8、325.129 5、297.129 5；拉非類共有子離子有m／z 262.086 3、135.044 1；西地那非類共有子離子有m／z 377.127 8、311.150 3、299.113 9、283.119 0；伐地那非類除具有西地那非類共有子離子外，還有特征子離子m／z 151.088 6；硫代那非類共有子離子有m／z 393.105 0、327.127 4 和299.096 1。

2.1.2 前體離子掃描范圍的設(shè)定

前體離子掃描范圍影響掃描的速度和靈敏度。根據(jù)已知的PDE-5 抑制劑的相對(duì)分子質(zhì)量設(shè)定合適的前體離子掃描范圍:拉非類前體離子掃描范圍為m／z 350 ～500，紅地那非類、西地那非類、伐地那非類和硫代那非類前體離子掃描范圍為m／z 400 ～600。

2.1.3 共有子離子的選擇

以2.1.1 節(jié)中各類代表化合物解析出的共有子離子建立前體離子掃描方法（由于本文使用的三重四極桿質(zhì)譜儀為低分辨質(zhì)譜，故設(shè)定m／z 參數(shù)均只保留一位小數(shù)），測(cè)定11 種對(duì)照品（即國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中11 種PDE-5 抑制劑）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)各子離子通道總離子流圖以及11 種已知化合物的提取離子流圖（見圖1 和圖2），判斷各子離子通道的靈敏度和同類化合物子離子碎片的共有性。為了達(dá)到專屬性要求，每類化合物應(yīng)選擇2 種或2 種以上的子離子。盡管增加子離子的監(jiān)測(cè)數(shù)量可以在一定范圍內(nèi)增強(qiáng)篩選的專屬性，但可能犧牲三重四極桿前體離子掃描的靈敏度，故每類化合物一般只篩選靈敏度較高的2 個(gè)共有子離子。

圖1 混合對(duì)照溶液的前體離子掃描總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of precursor ion scanning of mixed reference solution

紅地那非類共有碎片為m／z 325.1、297.1，拉非類共有碎片為m／z 135.0、262.1，西地那非類共有碎片為m／z 283.1、311.1，伐地那非類特征碎片為m／z 299.1、151.1，硫代那非類共有碎片為m／z 393.1、299.1。其中，西地那非和伐地那非的母核基本相同，碎片也相似，具有許多相同m／z 的共有碎片離子，m／z 283.1、311.1 和299.1 中有2 個(gè)即可推斷樣品中可能含有PDE-5 抑制劑（西地那非類或伐地那非類）；但是由于共軛環(huán)上雜原子的位置不同，導(dǎo)致伐地那非的優(yōu)勢(shì)裂解與西地那非不同，m／z 299.1 和151.1 的豐度較大，故同時(shí)選擇以提高伐地那非類的準(zhǔn)確度；硫代那非類與西地那非、伐地那非類均具有m／z 299.1 碎片，雖然結(jié)構(gòu)不同、準(zhǔn)確質(zhì)量不同（見表1），但是低分辨的三重四極桿質(zhì)譜無法區(qū)分，故設(shè)定合一。最終選擇m／z 135.0、151.1、262.1、283.1、297.1、299.1、311.1、325.1 和393.1共9 個(gè)子離子建立前體離子掃描方法。

2.2 11 種已知PDE-5 抑制劑的典型色譜圖

取1.2 節(jié)的系列混合對(duì)照品貯備液，以50%（v／v）乙腈稀釋成混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照建立的方法進(jìn)行測(cè)定，得到各通道的總離子流圖（見圖1）。

分別提取相應(yīng)化合物的前體離子m／z（11 種已知PDE-5 抑制劑的母離子信息見表1），得到9 個(gè)子離子通道的提取離子流圖（見圖2），其中圖2a 為紅地那非類特征子離子m／z 297.1、325.1 通道的提取離子流圖，代表化合物為那紅地那非（1）、紅地那非（2）；圖2b 為拉非類特征子離子m／z 135.0、262.1 通道的提取離子流圖，代表化合物氨基他達(dá)拉非（3）、他達(dá)拉非母離子（4）；圖2c 為西地那非類特征子離子m／z 283.1、311.1 通道的提取離子流圖，代表化合物羥基豪莫西地那非（5）、西地那非（6）、豪莫西地那非（8）、那莫西地那非（11）；圖2d 為伐地那非特征子離子m／z 299.1、151.1 通道的提取離子流圖，代表化合物伐地那非（7）、偽伐地那非（9）；圖2e 為硫代那非類特征子離子m／z 299.1、393.2 通道的提取離子流圖，代表化合物硫代艾地那非（10）。

2.3 11 種已知PDE-5 抑制劑的檢出限

取1.2 節(jié)的系列混合對(duì)照品貯備液，用50%（v／v）乙腈稀釋成分別約含拉非類0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5 mg／L，含其他那非類0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.5 mg／L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照建立的方法進(jìn)行測(cè)定，以各化合物檢出時(shí)對(duì)應(yīng)的各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為檢出限。各子離子通道檢測(cè)11 種已知PDE-5 抑制劑的檢出限結(jié)果見表2。

圖2 前體離子掃描通道的提取離子流圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of precursor ion scanning filters

表2 11 種已知PDE-5 抑制劑的檢出限Table 2 Limits of detection （LODs）of the 11 known PDE-5 inhibitors

2.4 應(yīng)用與討論

用已建立的前體離子掃描方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行篩選，在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn):用質(zhì)量較低的碎片m／z 135.0、151.1檢測(cè)拉非類和伐地那非類的靈敏度較高，但選擇性較差。因此必須結(jié)合該類別選擇的另一個(gè)特征離子才能更好地判定化合物是否為PDE-5 抑制劑。

圖3 為3 份實(shí)際樣品測(cè)定的色譜圖，圖3a 為樣品1 的色譜圖，檢測(cè)到化合物A、B，而經(jīng)過子離子通道分析可知它們均含有2 個(gè)拉非類特征子離子（m／z 135.0、262.1），說明A、B 為拉非類化合物；經(jīng)對(duì)照品確證化合物A、B 分別為氨基他達(dá)拉非、他達(dá)拉非。圖3b 為樣品2 的色譜圖，檢測(cè)到C、D 兩個(gè)化合物，經(jīng)過子離子通道分析，化合物C 含有西地那非類特征子離子（m／z 283.1、311.1），經(jīng)對(duì)照品確證化合物C 為西地那非；而化合物D 盡管含有拉非類其中的一個(gè)特征子離子（m／z 135.0），但是不含有另外的特征子離子（m／z 262.1），說明D 不屬于拉非類化合物，是非PDE-5 物質(zhì)。質(zhì)荷比較小的碎片雖然常為化合物的優(yōu)勢(shì)裂解碎片，靈敏度高，但由于結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，特征性不強(qiáng)，許多化合物都可以產(chǎn)生這些優(yōu)勢(shì)碎片，因而專屬性較差。在建立前體離子掃描方法時(shí)應(yīng)同時(shí)兼顧共有性和專屬性，降低假陽性的發(fā)生率。圖3c 是樣品3 的色譜圖，可見其沒有添加PDE-5，樣品為陰性。

對(duì)70 批實(shí)際抽樣樣品進(jìn)行分析，先通過總離子流圖判斷有無疑似色譜峰，再根據(jù)分類檢查各類子離子通道檢出的一致性。測(cè)定結(jié)果顯示所有陰性樣品的總離子流圖中均未發(fā)現(xiàn)疑似色譜峰，未出現(xiàn)假陰性結(jié)果；陽性樣品的測(cè)定結(jié)果與MRM 模式及質(zhì)譜全掃描模式的檢測(cè)結(jié)果均一致，快速篩查正確率為100%。這說明選擇的子離子專屬性良好，不易出現(xiàn)假陽性，可同時(shí)滿足日常檢驗(yàn)的要求。

本實(shí)驗(yàn)收集的樣品中未出現(xiàn)11 種對(duì)照化合物以外的新PDE-5 抑制劑衍生物，雖然未能直接證明該方法可篩選出未知PDE-5 抑制劑，但已有許多文獻(xiàn)［2，3，10，11］報(bào)道在保健食品中發(fā)現(xiàn)了非法添加的新衍生物，根據(jù)文獻(xiàn)給出的新衍生物結(jié)構(gòu)，可以推斷大多數(shù)新PDE-5 抑制劑的二級(jí)質(zhì)譜應(yīng)包含本文建立前體離子掃描方法的9 種共有子離子；通過整理文獻(xiàn)中明確列舉的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，得出有近20 種新衍生物（如表3 所示）具有文中列舉的典型碎片，可以歸屬于本文提出的5 大類PDE-5 抑制劑，說明該方法具有一定的普遍適用性，可推斷該方法可以滿足這些新衍生物的初步篩選。

表3 其他PDE-5 抑制劑的碎片和分類Table 3 Product ions and types of other PDE-5 inhibitors

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

圖3 3 個(gè)典型實(shí)際樣品測(cè)定的色譜圖Fig.3 Typical chromatograms of three actual samples

3 結(jié)論

靶點(diǎn)相同、藥理相近的化合物往往具有相似的結(jié)構(gòu)，PDE-5 抑制劑衍生物數(shù)量龐大，合成簡(jiǎn)單，是非法添加的重要藥物之一，受到國(guó)內(nèi)外廣泛的關(guān)注。采用LC-MS／MS 確證和篩選該類化合物已有很多報(bào)道，其效果得到普遍認(rèn)可。三重四極桿質(zhì)譜不同于離子阱質(zhì)譜，前者是空間上的串聯(lián)，后者是時(shí)間上的串聯(lián)，由于三重四極桿質(zhì)譜特殊的串聯(lián)方式，使其具有離子阱質(zhì)譜不具備的一些功能，如母離子掃描、中性碎片丟失掃描等，而人們往往只重視了三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)功能，忽略了其他功能［12］。

本研究試圖采用母離子掃描功能從復(fù)雜的中成藥和保健食品中篩選PDE-5 抑制劑。通過對(duì)已知PDE-5 抑制劑的結(jié)構(gòu)研究將其分為5 類，選擇最常見的5 種已知化合物作為代表，研究其二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律，推斷出各類共有碎片離子，初步建立前體離子掃描方法；用包括代表化合物在內(nèi)的11 種國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的已知PDE-5 抑制劑再次篩選共有離子，兼顧靈敏度和穩(wěn)定性，優(yōu)化方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的篩查測(cè)定；通過查閱文獻(xiàn)中提供的新衍生物的碎片信息，推斷該方法具有較普遍的實(shí)用性，可以滿足結(jié)構(gòu)相近的未知衍生物的初步篩選。

該方法掃描速度快、效率高、一次掃描同時(shí)確定多種結(jié)構(gòu)，尤其適合應(yīng)對(duì)新衍生物的非法添加，為今后非法添加物的檢測(cè)提供了一種新的思路和手段。

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