張權(quán)青， 張 磊， 高小迪， 張維冰， 張慶合*

（1. 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京100029；2. 華東理工大學(xué)，上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

生物蛋白質(zhì)在大小、相對(duì)豐度、酸堿度和疏水性等方面具有很大的差異。就相對(duì)含量而言，血液中的高豐度與低豐度蛋白質(zhì)含量甚至相差達(dá)11 個(gè)數(shù)量級(jí)，這也導(dǎo)致一些低豐度蛋白質(zhì)很難被分析檢測(cè)和研究。對(duì)生物功能產(chǎn)生重要影響的修飾蛋白質(zhì)、與重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)在體液或組織中的含量通常很低，也使對(duì)低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的研究成為生物分析領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題。

對(duì)蛋白質(zhì)樣品中低豐度組分的檢測(cè)通常需采用預(yù)富集的方法，通過(guò)提高其相對(duì)含量來(lái)有效地提高檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)精度。常用的蛋白質(zhì)富集技術(shù)主要有固相金屬離子親和色譜法（IMAC）［1-3］、分子印跡技術(shù)［4］、親和色譜技術(shù)［5］、特殊選擇性材料富集［6，7］、循環(huán)進(jìn)樣［8，9］等。固相金屬離子親和色譜法［10］是最常用的蛋白質(zhì)富集方法之一，錢小紅等［11］利用二氧化鈦對(duì)騰沖嗜熱厭氧菌磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行富集研究，鑒定到25 個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)；梁鑫淼等［12］利用氧化鋁進(jìn)行糖肽的選擇性富集，從辣根過(guò)氧化物酶解液中獲得16 個(gè)糖肽，從IgG 酶解液中獲得12 個(gè)糖肽。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡聚合物材料去除樣品中的高含量蛋白質(zhì)，可以有效避免其對(duì)低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)的影響，能夠?qū)⒅械秃康鞍踪|(zhì)的鑒定數(shù)量提高20%以上［13］。

循環(huán)進(jìn)樣方式可以有效提高色譜分析的絕對(duì)上樣量。Lv 等［8］采用循環(huán)進(jìn)樣結(jié)合超高效液相色譜（UPLC）-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)白花前胡中的6種同分異構(gòu)體進(jìn)行了分離和鑒定。杜敏等［9］發(fā)展了一種基于微流控芯片的生物樣品循環(huán)給樣富集方法，大大提高了信號(hào)強(qiáng)度，降低了檢出限。本文發(fā)展了一種大體積循環(huán)進(jìn)樣的方法，通過(guò)增加進(jìn)樣量與進(jìn)樣次數(shù)提高蛋白質(zhì)樣品的富集效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

依利特P1201 系列高效液相色譜系統(tǒng)（配UV1201 紫外-可見波長(zhǎng)檢測(cè)器，大連依利特分析儀器有限公司）；超純水儀（德國(guó)Sartorius 公司）；Heal Force Neofage 1600R 高速離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸（色譜純）、乙酸銨（分析純）（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；三氟乙酸（色譜純，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?；液氮（普通氮?dú)?，上海松閔氣體技術(shù)有限公司）。

1.2 豬肝蛋白質(zhì)的提取

［14］的蛋白質(zhì)提取方法，取新鮮豬肝10 g，攪拌碾磨成泥漿，加入10 倍體積的5% （v／v）乙酸溶液，在4 ℃下攪拌過(guò)夜；在室溫下以10 000 g離心30 min 后取上清液；沉淀中加入等體積乙酸混合，相同條件下離心，合并上清液，得豬肝蛋白質(zhì)樣品。豬肝蛋白質(zhì)樣品用流動(dòng)相溶解后過(guò)0.45 μm油膜后備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱:SinoChrom ODS-BP 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器公司）；流動(dòng)相:A 為0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液，B 為0.1%TFA 乙腈溶液。線性洗脫程序:0 ～10 min，5% B ～40% B；10 ～13 min，40%B ～100%B；13 ～20 min，100% B。流速:1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；柱溫:室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 豬肝蛋白質(zhì)分離條件的優(yōu)化

210 nm 和280 nm 為生物蛋白質(zhì)樣品通常的檢測(cè)波長(zhǎng)。在相同分離條件下，210 nm 時(shí)的色譜峰信號(hào)響應(yīng)明顯強(qiáng)于280 nm，因此選擇210 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

流動(dòng)相的種類與梯度條件對(duì)樣品的分離有著重要的影響。以SinoChrom ODS-BP 色譜柱進(jìn)行反相液相色譜分離流動(dòng)相條件優(yōu)化，在最佳色譜分離條件（見1.3 節(jié)）下得到圖1 所示的分離結(jié)果。

Fig.1 豬肝蛋白質(zhì)的反相液相色譜分離譜圖Fig.1 Chromatogram of pork liver separated by RPLC

2.2 進(jìn)樣的重復(fù)性

在大體積循環(huán)進(jìn)樣中，通過(guò)增加進(jìn)樣次數(shù)來(lái)增加樣品的絕對(duì)進(jìn)樣量。根據(jù)色譜基本原理，在線性色譜條件下，同一物質(zhì)在同樣的色譜分離條件下保留時(shí)間不變，因此在多次色譜實(shí)驗(yàn)中對(duì)相同保留時(shí)間段進(jìn)行收集，得到的餾分應(yīng)包含相同的組分。進(jìn)樣重復(fù)性的好壞，直接影響到組分收集的一致性。

通過(guò)3 次重復(fù)進(jìn)樣，每次25 μL，考察在優(yōu)化的色譜分離條件下豬肝蛋白質(zhì)分離的重復(fù)性。圖1 中峰1（4.57 min）和峰2（9.88 min）峰高的RSD（n ＝3）分別為5.9%和5.5%，表明系統(tǒng)及所發(fā)展的方法具有良好的進(jìn)樣重復(fù)性。

2.3 低豐度組分的選擇與富集效率的評(píng)價(jià)

根據(jù)RPLC 的洗脫原理，不同極性組分主要依靠疏水性進(jìn)行分離。相對(duì)而言，在0 ～10 min 對(duì)應(yīng)的是強(qiáng)極性流動(dòng)相，其收集的餾分為弱保留組分；在10 ～13 min 對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相極性逐漸減弱，將其收集的餾分定義為中等極性組分。根據(jù)色譜峰的信號(hào)強(qiáng)弱，選取保留時(shí)間為7 ～9 min、11 ～13 min 的中等極性組分及17 ～19 min 的較強(qiáng)保留組分作為研究對(duì)象評(píng)價(jià)方法。保留時(shí)間為9 ～11 min 時(shí)，色譜峰的信號(hào)較強(qiáng)，經(jīng)過(guò)循環(huán)進(jìn)樣富集后信號(hào)飽和，因此未選取此組分段進(jìn)行研究。

采用大體積循環(huán)進(jìn)樣的方式，進(jìn)樣11 次，每次上樣量500 μL。依次收集選擇的保留時(shí)間段的組分，并將其分別合并后，氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相B 溶解定容，再次進(jìn)行色譜分離。

圖2 中比較了經(jīng)過(guò)循環(huán)富集后17 ～19 min 的中等極性組分與原始圖譜的差別。圖3 和圖4 中分別比較了7 ～9 min、11 ～13 min 的中等極性組分與原始譜圖的差別。

從圖2 ～圖4 可以看出，采用循環(huán)富集的方法可以將不同時(shí)間段餾分有效去除，而其他富集目標(biāo)組分的含量得到有效提高。顯然，這種方法可同時(shí)用于高豐度蛋白質(zhì)的去除以及低豐度蛋白質(zhì)的富集。

在理想情況下，對(duì)于所收集到的餾分，其中每一種組分的絕對(duì)量為進(jìn)樣次數(shù)與進(jìn)樣體積以及其在原始樣品中濃度的乘積。對(duì)于17 ～19 min 餾分中的每一種組分而言，其在富集后再次溶解的50 μL 樣品中的濃度的理論值應(yīng)為其在原始樣品中濃度的110 倍。17 ～19 min 時(shí)間段的組分中，富集前因濃度太低譜圖中未出現(xiàn)色譜峰；經(jīng)過(guò)大體積的循環(huán)進(jìn)樣后，出現(xiàn)了新的色譜峰，其對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間為18.07、18.29 和19.15 min。

Fig.2 豬肝蛋白質(zhì)17 ～19 min 組分富集（a）前、（b）后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 17-19 min fraction of pork liver proteins （a）before and（b）after enrichment

Fig.3 豬肝蛋白質(zhì)11 ～13 min 組分富集（a）前、（b）后的色譜圖Fig.3 Chromatograms of 11-13 min fraction of pork liver proteins （a）before and （b）after enrichment

Fig.4 豬肝蛋白質(zhì)7 ～9 min 組分富集（a）前、（b）后的色譜圖Fig.4 Chromatograms of 7-9 min fraction of pork liver proteins （a）before and （b）after enrichment

對(duì)于11 ～13 min 的餾分以及7 ～9 min 的餾分，用流動(dòng)相B 溶解至100 μL，其理論富集倍數(shù)皆為55，選擇在富集前只有微弱信號(hào)的8.81、8.92、11.38 與12.58 min 組分進(jìn)行研究，結(jié)果見表1?？梢钥闯?，試驗(yàn)與理論富集倍數(shù)相近，說(shuō)明所發(fā)展的方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

對(duì)于不同的色譜峰，實(shí)際富集倍數(shù)有一些差別?？赡苁且?yàn)樵忌V圖中組分豐度很低，定量結(jié)果誤差較大，使得富集倍數(shù)的計(jì)算產(chǎn)生較大偏差，但這一現(xiàn)象并不影響所發(fā)展方法的實(shí)用性。

表1 不同色譜峰的富集效果Table 1 Enrichment results of different chromatographic peaks

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種大體積循環(huán)進(jìn)樣的蛋白質(zhì)樣品富集分離處理方法，也可用于去除高豐度蛋白質(zhì)對(duì)低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)的干擾。通過(guò)增加蛋白質(zhì)樣品的上樣體積，提高低豐度蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量；進(jìn)一步采用增加樣品進(jìn)樣循環(huán)次數(shù)的方法，提高蛋白質(zhì)的富集效率。實(shí)驗(yàn)與理論富集效率相近。所發(fā)展的方法為生物蛋白質(zhì)樣品研究提供了一種新的富集制備及檢測(cè)方法。

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