黃 露 ， 余麗雙， 陳毅挺

（1. 閩江學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，福建 福州350108；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

手性配體交換毛細(xì)管電泳（CLE-CE）是一種常見的毛細(xì)管電泳手性分離模式，主要用于氨基酸、羥基酸及二肽等對映體的手性拆分。CLE-CE 利用手性配體與中心離子形成的配合物與對映體發(fā)生交換作用來實(shí)現(xiàn)對映體的手性拆分。因此，手性配體的選擇在CLE-CE 體系中是至關(guān)重要的。目前，CLECE 的手性配體主要是一些氨基酸［1，2］、氨基醇［3］及α-羥基酸等［4］。離子液體是在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)、完全由陰陽離子組成的鹽，一般由有機(jī)陽離子和無機(jī)陰離子組合而成。離子液體具有很多獨(dú)特性能，諸如無味、不燃、蒸汽壓低、可操作溫度范圍寬、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好、離子遷移和擴(kuò)散速度快等。如果將手性基團(tuán)引入到離子液體結(jié)構(gòu)中，那么就能獲得具有手性特征的離子液體。手性離子液體結(jié)合了離子液體和手性物質(zhì)兩方面的優(yōu)點(diǎn)和特性，其作為手性溶劑或手性誘導(dǎo)劑，已被成功用于不對稱合成［5，6］、氣相色譜［7］、液相色譜［8，9］和毛細(xì)管電泳［10-13］等領(lǐng)域。目前，已有少數(shù)手性離子液體被當(dāng)作手性配體用于毛細(xì)管電泳手性分離，如1-烷基-3-甲基咪唑-L-脯氨酸［10］、L-鳥氨酸為陰離子部分的手性離子液體［14］、L-脯氨酸為陽離子部分的手性離子液體［15］以及L-賴氨酸為陰離子的手性離子液體［16］。本 文 以 1-乙 基-3-甲 基 咪 唑 L-乳 酸 鹽（［EMIM］［L-Lac］）為手性配體，以色氨酸對映體（Trys）、苯丙氨酸對映體（Phes）、酪氨酸對映體（Tyrs）為拆分對象，對影響手性拆分的諸多因素進(jìn)行考察，建立［EMIM］［L-Lac］拆分手性對映體的新方法。同時(shí)將L-乳酸（L-Lac）作為手性配體用于Trys 的手性拆分，對L-Lac 和［EMIM］［L-Lac］的手性拆分能力進(jìn)行對比。最后在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對手性拆分機(jī)理進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

D-色氨酸、L-色氨酸、D-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-酪氨酸和L-酪氨酸（純度為99%，Aladdin）；［EMIM］［L-Lac］和EMIM-Ace（純度為99%，上海成捷化學(xué)有限公司）；L-乳酸（純度為99%，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化銅和其他藥品及試劑均為分析純，購于天津福晨化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 電泳操作

電泳分離均在俄羅斯劉梅克斯公司的CAPEL 105 型毛細(xì)管電泳儀上完成。采用的未涂層石英毛細(xì)管購于河北永年縣銳灃色譜器件有限公司，規(guī)格為50 μm i. d. ×61 cm（有效長度52 cm）。進(jìn)樣前，毛細(xì)管分別用0.1 mol／L NaOH、水和電泳緩沖溶液沖洗5 min，再在25 kV 電壓下平衡10 min。樣品采用壓力進(jìn)樣（3.5 kPa，30 s），分離電壓為25 kV，分離溫度為20 ℃，檢測波長為200 nm。

3 對對映體樣品分開配制。D-Try 和L-Try，以及D-Phe 和L-Phe 直接用水溶解至1 g／L。D-Tyr和L-Tyr 先用0.1 mol／L NaOH 溶解后再加水至1 g／L。使用前按照需要用水稀釋。運(yùn)行緩沖液的配制:將手性配體和金屬鹽直接溶于水中，再用1 mol／L HCl 或1 mol／L NaOH 調(diào)節(jié)至所需pH 值。所有溶液注入毛細(xì)管前均需用0.45 μm 孔徑濾膜過濾。

1.3 計(jì)算

對映體的電滲流速率（μeof）計(jì)算參照公式（1）:

其中Lt是毛細(xì)管的總長，Ld是毛細(xì)管的有效長度，V 是分離電壓，teof是丙酮的遷移時(shí)間［17］。

對映體的有效電泳遷移速率（μep）計(jì)算參照公式（2）［18］:

其中tm是對映體的遷移時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 背景電解質(zhì)的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，［EMIM］［L-Lac］不溶于磷酸鹽或硼砂等常規(guī)緩沖介質(zhì)，配制過程中會(huì)產(chǎn)生白色絮狀物沉淀。因此，直接將［EMIM］［L-Lac］和氯化銅用作背景電解質(zhì)，水為溶劑。

2.2 中心離子的選擇

針對中心離子，主要對4 種常見的二價(jià)金屬離子（Cu2＋、Ni2＋、Zn2＋及Co2＋）進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用Ni2＋、Zn2＋和Co2＋作為中心離子，Trys、Phes 和Tyrs 毫無拆分趨勢，而Cu2＋表現(xiàn)出較好的手性拆分能力。此外，銅鹽的陰離子對手性拆分也有很大的影響。相同條件下，使用硫酸銅和醋酸銅提供中心離子時(shí)，對映體只有極微的拆分趨勢；而使用氯化銅時(shí)，對映體則能接近基線分離。因此，最后選擇氯化銅作為中心離子提供試劑。

2.3 ［EMIM］［L-Lac］與Cu2 ＋的物質(zhì)的量比與濃度的影響

手性配體與中心離子的物質(zhì)的量比和濃度對對映體的手性拆分均有很大影響。圖1 顯示了［EMIM］［L-Lac］與Cu2＋的物質(zhì)的量比對Trys、Phes 和Tyrs 分離度（Rs）和遷移時(shí)間的影響?？梢钥闯?，隨著物質(zhì)的量比的增大，手性分離度會(huì)隨之增大，然而當(dāng)物質(zhì)的量比超過一定程度后，手性分離度便會(huì)隨之減??；遷移時(shí)間則隨之增大。實(shí)驗(yàn)最終確定［EMIM］［L-Lac］與Cu2＋的物質(zhì)的量比為2∶1。

固定手性配體與中心離子的物質(zhì)的量比，進(jìn)一步考察了不同濃度的手性配體與中心離子對3 對對映體手性拆分的影響（如圖2 所示）。當(dāng)［EMIM］［L-Lac］與Cu2＋的濃度過小時(shí)，3 對對映體不能得到手性拆分；濃度過大時(shí)，對映體的檢測靈敏度會(huì)隨之降低，手性分離度也隨之減小。實(shí)驗(yàn)最終確定［EMIM］［L-Lac］與Cu2＋的濃度分別為40 mmol／L和20 mmol／L。值得注意的是，使用氯化銅作中心離子提供試劑時(shí)，由于氯離子具有微弱的配位能力，因此會(huì)產(chǎn)生背景系統(tǒng)峰。

2.4 pH 的影響

緩沖溶液pH 值范圍的選擇主要取決于所選用的中心離子。通常情況下，Cu2＋在弱酸性條件下具有較好的手性拆分能力。因此，我們考察的pH 范圍為3.5 ～5.5。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著pH 值的升高，手性分離度先增大后減小。此外，遷移時(shí)間隨著pH 的增大而縮短。綜合考慮手性分離度和遷移時(shí)間，最終選定4.5 作為運(yùn)行緩沖液的pH 值。

綜上所述，Trys、Phes 和Tyrs 的最佳手性拆分條件 為20.0 mmol／L 氯 化 銅 及40.0 mmol／L［EMIM］［L-Lac］混合液（pH 4.5），此時(shí)，Trys、Phes和Tyrs 的手性拆分情況如圖2 所示。

圖1 ［EMIM］［L-Lac］與Cu2 ＋的物質(zhì)的量比對Rs 和遷移時(shí)間的影響Fig.1 Effects of the ratio of［EMIM］［L-Lac］to Cu2 ＋on Rs and migration time

2.5 對比實(shí)驗(yàn)

圖2 Tyrs、Phes 和Trys 的手性拆分圖Fig.2 Enantioseparation of Trys，Phes and Tyrs

為了驗(yàn)證［EMIM］［L-Lac］的良好性能，實(shí)驗(yàn)將L-乳酸作為手性配體用于Trys 的手性拆分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用L-乳酸時(shí)，Trys 只能得到部分拆分；加入EMIM-Ace 后，Trys 手性分離情況得到了很大改善。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對L-乳酸體系及EMIM-Ace 輔助L-乳酸體系的分離條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳拆分效果如圖3a 和3b 所示?？梢钥闯?，使用EMIM-Ace 輔助L-乳酸進(jìn)行手性拆分時(shí)，Trys 出峰時(shí)間非常長，且峰形展寬現(xiàn)象較為嚴(yán)重。而最佳實(shí)驗(yàn)條件下，使用［EMIM］［L-Lac］進(jìn)行手性拆分時(shí)（如圖3c 所示），Trys 在15 min 內(nèi)均已出峰。另外，實(shí)驗(yàn)還對80 mmol／L ［EMIM］［L-Lac］和40 mmol／L Cu2＋（pH 3.5）拆分Trys 的情況進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此條件下Trys 的分離情況很差，出峰時(shí)間為19 ～20 min。與相同條件下的 L-乳酸體系相比，［EMIM］［L-Lac］體系的出峰時(shí)間仍然較短。

圖3 Trys 手性拆分對比圖Fig.3 Comparison charts on enantioseparation of Trys

2.6 分離機(jī)理

CLE-CE 主要是依靠對映體與手性配體和中心離子形成的配合物的穩(wěn)定性差別進(jìn)行手性拆分的。不同的穩(wěn)定性導(dǎo)致了不同的遷移時(shí)間，因而對映體才能被分離。而對映體的遷移時(shí)間主要取決于μep和μeof。因此，可以通過分析μep和μeof來推斷分離機(jī)理。

如圖4a 所示，隨著［EMIM］［L-Lac］濃度的增大，每對對映體μep的差別先增大后減小，這與Rs的變化相一致。Trys、Phes 和Tyrs 的等電點(diǎn)分別為5.89、5.48 和5.66。因此在pH 4.5 的情況下，各對映體以陽離子形式存在，μep應(yīng)為正值。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。另外，從圖4b 可以看出，當(dāng)［EMIM］［LLac］的濃度從20 增加到80 mmol／L 時(shí)，μeof從1.79×10-4降至0.961 ×10-4cm2V-1s-1。

手性拆分機(jī)理如圖5 所示。通常情況下，毛細(xì)管內(nèi)壁由于硅羥基的質(zhì)子化而帶負(fù)電荷，這樣會(huì)使得陽離子在內(nèi)壁上發(fā)生聚集，當(dāng)施加一定正向電壓時(shí)，陽離子會(huì)帶動(dòng)溶液整體往負(fù)極運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)［EMIM］［L-Lac］進(jìn)入毛細(xì)管后，［EMIM］［LLac］在水溶液中會(huì)形成解離平衡。部分解離的咪唑陽離子會(huì)吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁上，使毛細(xì)管內(nèi)壁帶上正電荷，這些正電荷會(huì)引起負(fù)電荷聚集，從而使得原本正電荷聚集所產(chǎn)生的電滲流被抑制。隨著［EMIM］［L-Lac］濃度的增加，越來越多解離的咪唑陽離子會(huì)吸附在管壁上，從而導(dǎo)致電滲流進(jìn)一步降低、遷移時(shí)間進(jìn)一步延長。另外，溶液中未解離的［EMIM］［L-Lac］經(jīng)過兩步反應(yīng)生成三元配合物。而解離的L-乳酸根陰離子會(huì)與H＋結(jié)合生成L-Lac，L-Lac 也會(huì)經(jīng)由兩步反應(yīng)生成三元配合物。

圖4 ［EMIM］［L-Lac］的濃度對（a）μep和（b）μeof的影響Fig.4 Effects of［EMIM］［L-Lac］concentration on （a）μep and （b）μeof

圖5 ［EMIM］［L-Lac］作手性配體的手性拆分機(jī)理Fig.5 Mechanism of enantioseparation using［EMIM］［L-Lac］as the chiral ligand

參照2.5 節(jié)對比實(shí)驗(yàn)部分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用EMIM-Ace 輔助L-Lac 進(jìn)行手性拆分時(shí)，只需加入5 mmol／L EMIM-Ace，就能明顯降低電滲流并延長遷移時(shí)間（如圖3b 所示）。因此可以推斷，在EMIMAce 輔助L-Lac 體系中，EMIM-Ace 僅被用于抑制電滲流，并未參與手性配體交換反應(yīng)。而在［EMIM］［L-Lac］體系中，參與手性配體交換反應(yīng)的主要是未解離的［EMIM］［L-Lac］，而不是解離后的L-乳酸根離子形成的L-乳酸。因?yàn)槿绻麉⑴c手性配體交換反應(yīng)的主要是L-Lac，那么將會(huì)形成大量解離的咪唑陽離子，而大量的咪唑陽離子勢必會(huì)大大降低電滲流并延長遷移時(shí)間。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻相反，使用80 mmol／L［EMIM］［L-Lac］時(shí)，Trys 的遷移時(shí)間反而更短。這一現(xiàn)象證實(shí)了參與手性配體交換反應(yīng)的主要是未解離的［EMIM］［L-Lac］，且［EMIM］［LLac］在運(yùn)行緩沖液中只發(fā)生部分解離。這是因?yàn)槿浜衔锏男纬墒沟萌芤褐形唇怆x的［EMIM］［LLac］減少，從而使反應(yīng)朝著結(jié)合的方向進(jìn)行，抑制了［EMIM］［L-Lac］的解離。綜上所述，CLE-CE 中手性離子液體對手性拆分的影響并不僅僅是陰離子和陽離子影響的簡單疊加。相對于簡單的手性配體，手性離子液體由于其分子體積較大，生成的三元配合物的穩(wěn)定性差異也較大，因而表現(xiàn)出更好的手性拆分能力。

3 結(jié)論

本文利用手性配體交換毛細(xì)管電泳法，成功地將1-乙基-3-甲基咪唑L-乳酸鹽作為手性配體用于色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸對映體的手性拆分。與L-乳酸作手性配體相比，［EMIM］［L-Lac］表現(xiàn)出良好的手性拆分能力。研究證實(shí)了基于α-羥基酸為陰離子的手性離子液體在手性拆分上的可行性，并預(yù)示了其在毛細(xì)管電泳中的應(yīng)用前景。

［1］ Qi L，Yang G L，Zhang H Z，et al. Talanta，2010，81（4／5）:1554

［2］ Zhang H Z，Qi L，Qiao J，et al. Anal Chim Acta，2011，691（1／2）:103

［3］ Rizkov D，Mizrahi S，Cohen S，et al. Electrophoresis，2010，31（23／24）:3921

［4］ Kuo C Y，Liao K S，Liu Y C，et al. Molecules，2011，16（2）:1682

［5］ Siyutkin D E，Kucherenko A S，Struchkova M I，et al. Tetrahedron Lett，2008，49（7）:1212

［6］ Zhang L，Luo S Z，Mi X L，et al. Org Biomol Chem，2008，6（3）:567

［7］ Ding J，Welton T，Armstrong D W. Anal Chem，2004，76（22）:6819

［8］ Bi W T，Tian M L，Row K H. Analyst，2011，136:379

［9］ Tang F，Zhang Q L，Ren D D，et al. J Chromatogr A，2010，1217:4669

［10］ Liu Q，Wu K K，Tang F，et al. Chem-A Eur J，2009，15（38）:9889

［11］ Zhang J J，Du Y X，Zhang Q，et al. J Chromatogr A，2013，1316:119

［12］ Zhang Q，Du Y X. J Chromatogr A，2013，1306:97

［13］ Zhang J J，Du Y X，Zhang Q，et al. Talanta，2014，119:193

［14］ Mu X，Qi L，Shen Y，et al. Analyst，2012，137（18）:4235

［15］ Mu X Y，Qi L，Zhang H Z，et al. Talanta，2012，97:349

［16］ Zhang H Z，Qi L，Shen Y，et al. Electrophoresis，2013，34（6）:846

［17］ Zheng Z，Wei Y，Lin J M. Electrophoresis，2004，25:1007

［18］ Li D，Wang Z，Wang L，et al. Chromatographia，2009，70:825