文/周洪巖

內(nèi)蒙古扎蘭屯林業(yè)學(xué)校 內(nèi)蒙古興安盟 162650

優(yōu)化木霉( Trichoderum spp.)被認為是最有希望的生物防治因子。據(jù)統(tǒng)計全世界25個國家和美國 43個州的生物防治課題中，大約34%是有關(guān)木霉的研究。木霉屬中應(yīng)用最多的為哈茨木霉( T. harziarum)，常用劑型為麥麩制劑。哈茨木霉一般先通過PDA培養(yǎng)基進行一級培養(yǎng)后，再將孢子洗脫后植入麥麩中進行二級培養(yǎng)，因而其培養(yǎng)周期長、成本高。在一定程度上一級培養(yǎng)技術(shù)制約了哈茨木霉的規(guī)模生產(chǎn)。近年來，液體培養(yǎng)技術(shù)在微生物培養(yǎng)中應(yīng)用較多，有關(guān)哈茨木霉液體培養(yǎng)技術(shù)的文獻對木霉液體培養(yǎng)技術(shù)作了些探討和實踐，表明哈茨木霉液體培養(yǎng)技術(shù)具有培養(yǎng)周期短、孢子產(chǎn)量大、工業(yè)化程度高等優(yōu)點，完全可以在一級培養(yǎng)中代替PDA 固體培養(yǎng) ，這為哈茨木霉進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)突破了關(guān)鍵的一環(huán)；同時也為冬蟲夏草頭孢發(fā)酵過程中所排放的廢液找到了生物利用的出路，減少了對環(huán)境所產(chǎn)生的污染，并為其他類似微生物培養(yǎng)廢液的生物利用提供了一條綜合開發(fā)的思路，具有較強的實用價值。

1 試驗材料和方法

1.1 菌種來源

哈茨木霉菌株是分離自實驗室栽培食用菌灰樹花時染菌的菌袋，由于當時觀察到該菌株生長速度極快，很快覆蓋了被污染的灰樹花菌絲，并迅速長滿菌袋，因此判斷可能成為較好的生物防治菌劑來源，遂對其進行了分離。

1.2 主要試劑

PDB培養(yǎng)液：馬鈴薯（去皮200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL）。

1.3 主要儀器設(shè)備

醫(yī)用型潔凈工作臺（DL-CJ-1F，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造）；

人工氣候箱 （HPG-400H，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造）；

智能氣候培養(yǎng)箱（ZPQ-400，哈爾濱東拓科技開發(fā)有限公司制造）；

圖1 不同溫度7d的分生孢子產(chǎn)生情況

圖2 不同溫度7d的菌絲干重情況

圖3 不同pH值7d時的產(chǎn)孢情況

圖4 初始pH值對菌絲干重的影響

微量移液器（Finnplpette Theron Electron）；

冰箱(NABILA INDESIT) ；

微波爐（MZ-2270M, 海爾）；

光學(xué)顯微鏡（Motic B1SERIES，SYSTEM MICROSCOPES）；

高壓滅菌鍋（SANYO Autoclave MLS-3020，SANYO Electric Co. Ltd.，Made In Japan）；

架盤藥物天平(HC-TP11-5，上海精科)；

攝影顯微鏡（Olympus BX51）。

1.4 試驗方法

將在9cm PDA平板上生長7d的哈茨木霉菌（2號菌株）孢子，用無菌水10mL洗，用血球計數(shù)器調(diào)制成濃度為107cfu/mL的孢子懸浮液。

PDB培養(yǎng)液的制備：馬鈴薯（去皮200g），用紗布包裹加入盛有1000mL蒸餾水的煮鍋中，煮沸20分鐘后加入20g葡萄糖，攪拌至溶化，每250mL三角瓶中加入100mL PDB培養(yǎng)液。

接菌：將用高壓滅菌鍋滅菌的盛有PDB培養(yǎng)液的三角瓶，移液槍槍頭等物品放入操凈工作臺，用移液槍吸取107個/mL濃度的孢子懸浮液接菌至三角瓶，吸取量根據(jù)需求而定。

1.4.1 不同溫度對哈茨木霉生長的影響

每250mL三角瓶中加入100mL PDB培養(yǎng)液，分別在8、16、21、25、30℃恒溫下靜置培養(yǎng)，每處理3瓶，7d鏡檢分生孢子的產(chǎn)生情況，并稱量菌絲干重。

1.4.2 不同pH對哈茨木霉生長的影響

以1mol/L HCl和1mol/L NaOH的溶液分別將三角瓶中的溶液pH調(diào)到2、4、6、8、10、12，接種后分別于25℃恒溫條件下靜置培養(yǎng)，每處理3瓶，7d鏡檢分生孢子的產(chǎn)生情況，并稱量菌絲干重。

pH的調(diào)制：利用移液槍吸取一定量的HCl或者NaOH加入盛有PDB培養(yǎng)液的三角瓶中，用玻璃棒蘸取少許培養(yǎng)液點加在pH試紙上比對以確定配得所需pH值。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對哈茨木霉生長的影響

由表1、圖1和圖2可見，哈茨木霉在溫度為25℃時產(chǎn)生分生孢子量最大，菌絲干重最小。而菌絲干重最大是在8℃，此時分生孢子量最小。

2.2 不同pH對哈茨木霉生長的影響

由表2、圖3和圖4可見，哈茨木霉在pH=6時產(chǎn)生分生孢子量最大，菌絲干重最小。而菌絲干重最大是在pH=12時，此時分生孢子量最小。

目前木霉菌劑的生產(chǎn)多為孢子制劑，為了今后大規(guī)模生產(chǎn)木霉菌劑，對哈茨木霉菌的液體發(fā)酵條件進行了初步研究。研究發(fā)現(xiàn)：哈茨木霉在溫度為25℃時產(chǎn)生分生孢子量最大。而菌絲干重最大是在8℃，此情況下分生孢子量最小。在pH=6時分生孢子量最大，菌絲干重最小。而菌絲干重最大是在pH=12，此情況下分生孢子量最小。

雖然這只是實驗室內(nèi)的小規(guī)模實驗，但對大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。