程 丹， 陳光朗， 孫成磊， 陽立波， 曹樹青

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

0 引 言

水分不足是限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因子，提高植物自身抗旱性和水分利用效率來發(fā)展農(nóng)業(yè)具有重要的意義。研究表明，植物的抗旱性是由多基因控制的，不同作物和不同品種適應(yīng)干旱的方式是多種多樣的［1］。探討作物的抗旱機(jī)理、提高水分利用效率、改良作物的抗旱性是目前農(nóng)業(yè)科學(xué)倍受關(guān)注的研究內(nèi)容［2］。培育耐旱作物的主要途徑有：將野生耐旱植物馴化成作物的傳統(tǒng)育種；利用組織培養(yǎng)和誘變生物技術(shù)產(chǎn)生突變表型進(jìn)行培育；基因工程培育等。利用正向遺傳學(xué)途徑，篩選抗旱突變體并分離抗旱主效基因是培育耐旱作物品種的主要方法［3］。本文利用甘露醇模擬干旱環(huán)境，篩選出一株抗旱突變株，并利用TAIL－PCR克隆出其抗旱csm2基因。該研究為進(jìn)一步闡明干旱脅迫的分子機(jī)理、提高植物的抗旱能力具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis）生態(tài)型為Columbia，突變體庫均來自美國擬南芥種質(zhì)資源中心，實(shí)驗(yàn)采用2種方法培養(yǎng)植株［4］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥抗旱突變體的篩選

以確定濃度的甘露醇配制MS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。在培養(yǎng)皿中央點(diǎn)野生型種子作為對照，其余部分點(diǎn)突變體種子，水平放置培養(yǎng)。定期觀察并拍照，若有能生長的突變體幼苗，作為候選突變體，將之移栽到土壤中培養(yǎng)［5］。

1.2.2 擬南芥抗旱突變體的鑒定

分別將突變體和野生型種子點(diǎn)種于含有400mmol／L甘露醇的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)皿封口后放入4℃冰箱中春化2d后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀察生長情況。

1.2.3 基因克隆

利用CTAB法提取鑒定過的突變株的基因組DNA［6］。利用TAIL－PCR技術(shù)克隆突變體突變基因［7－8］。取100ng的突變體基因組 DNA，TDNA插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列利用特異引物（SP）、隨機(jī)引物（AD）序列以及PCR反應(yīng)程序進(jìn)行TAILPCR擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)主要采用1組巢式引物L(fēng)exA2、LexA3、LexA6，1個(gè)隨機(jī)引物 AD2，利用TAIL－PCR技術(shù)對T－DNA側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增，得到1條750bp左右的片段，將所獲得的序列與TAIR中的已知基因進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T－DNA插入片段的側(cè)翼序列屬于擬南芥的At1g07530基因。

1.2.4 驗(yàn)證 TAIL－PCR結(jié)果

突變體和野生型總RNA的提取和純化參照改良的Trizol法［9］。純化后的RNA以O(shè)ligo（dT）為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以合成的cDNA為模板，驗(yàn)證TAIL－PCR結(jié)果的可靠性，并運(yùn)用RT－PCR分析突變體和野生型體內(nèi)cDNA中At1g07530基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥抗旱突變體的篩選及鑒定

在400mmol／L甘露醇條件下，野生型均不能發(fā)芽，但突變體可正常發(fā)芽，表明篩選出的csm2－1突變體為抗旱突變體，如圖1所示。

將野生型和csm2－1突變體分別點(diǎn)在MS培養(yǎng)基和400mmol／L甘露醇條件下的MS培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)在 MS培養(yǎng)基中，csm2－1突變體和野生型的生長無顯著差異，而在400mmol／L甘露醇條件下，csm2－1根長顯著長于野生型，且其發(fā)芽率也顯著高于野生型，如圖2所示。

圖1 甘露醇濃度為400mmol／L時(shí)篩選的候選突變體

圖2 突變體的表型鑒定

2.2 基因克隆

利用TAIR－PCR技術(shù)對T－DNA側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條750bp左右的片段，如圖3所示，將所獲得的序列與TAIR中的已知基因進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆的基因片段中有666bp堿基連續(xù)與擬南芥At1g07530基因序列完全吻合，且T－DNA插入片段的側(cè)翼序列在At1g07530基因內(nèi)部的1 520bp處。

圖3 突變體TAIL－PCR結(jié)果

2.3 TAIL－PCR結(jié)果的驗(yàn)證

為驗(yàn)證TAIL－PCR結(jié)果，設(shè)計(jì)了1對位于TDNA插入點(diǎn)位置兩側(cè)的引物F和R，并結(jié)合TAIL－PCR的特異引物之一LexA6進(jìn)行PCR鑒定。以野生型和突變體的基因組DNA為模板，分別利用引物F和R、LexA6和R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖4所示，野生型可以擴(kuò)增出符合預(yù)期大?。? 050bp）的目的P7段（泳道1），而在突變體中擴(kuò)增出目的條帶（泳道4），由于野生型未插入TDNA片段，因而LexA6在野生型中不存在結(jié)合靶序列，相反在突變體中存在LexA6結(jié)合靶序列，因此LexA6與R間的片段未能擴(kuò)增得到（泳道3），而在突變體中得到了相應(yīng)的片段（980bp）。這 說 明 在 突 變 體csm2－1 中 的At1g07530基因的確存在 T－DNA 插入，即TAIL－PCR結(jié)果真實(shí)可靠［10］。

為進(jìn)一步確定csm2－1的干旱耐受性是由于T－DNA插入導(dǎo)致At1g07530基因失活所致，進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR），結(jié)果表明，在突變體中At1g07530基因沒有表達(dá)，而在野生型中，該基因可以正常表達(dá)，如圖5所示。這說明突變體的干旱耐受表型確實(shí)是由于At1g07530基因的缺失引起的。

圖4 T－DNA插入位置

圖5 RT－PCR驗(yàn)證At1g07530基因表達(dá)情況

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分離出的抗旱突變體csm2－1與野生型相比表現(xiàn)出顯著的抗旱性，通過鑒定確定csm2－1是抗旱突變體。利用TAIL－PCR克隆出csm2的抗旱基因，并通過PCR及RT－PCR等方法證實(shí)了突變體是由于T－DNA插入At1g07530基因，導(dǎo)致該基因不能表達(dá)所致。

對環(huán)境脅迫響應(yīng)基因的分離鑒定及其相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究是探討植物潛化抗逆機(jī)制的重要方法之一，利用轉(zhuǎn)基因等相關(guān)技術(shù)能夠有效提高作物抵御環(huán)境脅迫的能力［11－12］。但是csm2基因在擬南芥信號(hào)傳遞中的功能還需進(jìn)一步解析，其對干旱脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其應(yīng)答脅迫的分子機(jī)制將是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

［1］ 張 彤，齊 麟.植物抗旱機(jī)理研究進(jìn)展［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（4）：107－110.

［2］ 喻方圓，錫 增.植物逆境生理研究進(jìn)展［J］.世界林業(yè)研究，2003，16（5）：6－11.

［3］ 王建革，蘇曉華，張冰玉.植物抗旱研究工作中的問題與方法初探［J］.中國農(nóng)學(xué)報(bào)，2004，20（3）：93－96.

［4］ Shinozaki K，Yamaguchi－Shinozaki K，Seki M.Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses［J］.Curr Opin Plant Biol，2003，6（5）：410－417.

［5］ Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures［J］.Physiol Plant，1962，15：473－497.

［6］ 張嬌嬌，江 力，楊 杰，等.擬南芥抗旱突變體的篩選和鑒定［J］.合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，35（4）：531－535.

［7］ 安鑫龍，董金皋，韓建民.應(yīng)用CTAB法提取玉米大斑病菌DNA［J］.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（1）：38－41.

［8］ Liu Y G，Whitter R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1and YAC clones for chromosome walking［J］.Genomics，1995，25：674－681.

［9］ 羅麗娟，施季森.一種DNA側(cè)翼序列分離技術(shù)：TAIL－PCR［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，27（4）：87－90.

［10］ Sternberg D，Mandels G R.Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by sophorose［J］.J Bacteriol，1979，139：761－769.

［11］ 劉 浩，蘇 凡，王棚濤.利用TAIL－PCR方法克隆擬南芥干旱主效基因NCED3［J］.河南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，39（6）：621－625.

［12］ 劉 強(qiáng)，張 勇，陳受宜.干旱、高鹽及低溫誘導(dǎo)的植物蛋白激酶基因［J］.科學(xué)通報(bào)，2000，45（6）：561－566.