劉雅輝， 王秀萍， 魯雪林， 張國新， 李 強(qiáng)

(河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 曹妃甸 063200)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要脅迫因子。中國的鹽漬土近1.00×108hm2，且鹽漬化和次生鹽漬化土地面積不斷擴(kuò)大［1-2］。河北省鹽漬土主要分布在沿渤海一帶的秦皇島、唐山、滄州等地，鹽漬化面積大，鹽堿程度高，土壤結(jié)構(gòu)差，作物難以正常生長，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此合理開發(fā)利用鹽堿地是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位［3-4］。在糧棉爭地矛盾日益突顯的情況下，棉花以其較好的耐鹽性，逐漸成為鹽堿地一種新的優(yōu)勢作物。目前，中國是世界上鹽堿地植棉規(guī)模最大的國家，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)［5］，中國植棉區(qū)內(nèi)鹽堿地約有 1.67 ×107hm2，其中超過2.67×106hm2已先后開發(fā)植棉。河北省的棉花種植面積也不斷擴(kuò)大，逐漸延伸到黑龍港地區(qū)和沿渤海一代的鹽堿地區(qū)域。因此，培育和推廣耐鹽棉花新品種是提高鹽堿地生產(chǎn)力的長久之計(jì)，也是目前鹽堿地利用的一種有效手段。耐鹽棉花品種一般需要有較強(qiáng)的出苗能力和抗鹽能力，這給篩選和培育耐鹽棉花品種提出了挑戰(zhàn)，而分子標(biāo)記技術(shù)不僅為棉花耐鹽性篩選提供分子鑒定，同時(shí)也為新種質(zhì)或品種的選育開辟了新的技術(shù)途徑。

植物的耐鹽性是一個(gè)及其復(fù)雜的性狀，同時(shí)受環(huán)境和植物發(fā)育時(shí)間與空間的影響。有研究發(fā)現(xiàn)許多植物耐鹽性狀受少數(shù)主基因控制，存在耐鹽主效基因［6-10］，因此通過尋找與耐鹽基因密切連鎖的分子標(biāo)記，對于改善植物的耐鹽性是可行且十分必要的。目前，在水稻、小麥、大麥、大豆、玉米、苜蓿、結(jié)縷草等植物中，已檢測到與耐鹽相關(guān)的分子標(biāo)記［11-19］，且部分已被定位和克?。?2-13，20-24］。到目前為止，有關(guān)棉花耐鹽性分子水平的研究不多，與其相關(guān)的分子標(biāo)記則更少。張麗娜等［25］通過SSR標(biāo)記篩選出10對區(qū)分耐鹽材料和敏鹽材料的SSR引物，初步認(rèn)為采用SSR標(biāo)記可以鑒定棉花耐鹽性;郭繼坤［26］采用SSR標(biāo)記以魯棉97-8和蘇12為親本及184個(gè)單株的F2群體為材料，構(gòu)建了一個(gè)包含8個(gè)連鎖群、25個(gè)標(biāo)記的遺傳圖譜，并定位了4個(gè)控制不同生育期耐鹽性的QTLs。可見，篩選棉花耐鹽性分子標(biāo)記是切實(shí)可行的。

本研究擬以耐鹽性差異大的兩個(gè)親本為材料利用SRAP技術(shù)和BSA法篩選與棉花耐鹽相關(guān)的分子標(biāo)記，然后用其雜交組合的F2分離群體及26份耐、敏鹽品種(品系)對標(biāo)記進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，以期獲得與棉花耐鹽相關(guān)的分子標(biāo)記，從而為棉花耐鹽種質(zhì)鑒定及耐鹽棉花分子標(biāo)記輔助育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

選用耐鹽材料NY1×敏鹽材料中棉所12的F2分離群體，及26個(gè)耐、敏鹽性品種(系)作為試驗(yàn)材料。26個(gè)耐(敏)鹽品種通過河北省地方標(biāo)準(zhǔn)《棉花耐鹽性鑒定評價(jià)技術(shù)規(guī)范》［27］鑒定，22個(gè)為耐鹽品種，4個(gè)敏鹽品種(表1)。

SRAP引物參照Li等［28］公布的通用引物，共組成88對引物，引物序列由北京華大基因研究中心合成。

表1 26份耐(敏)鹽棉花材料名稱、來源及耐鹽性Table 1 Names，sources and salinity tolerance of 26 cotton materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 F2群體的耐鹽性鑒定 試驗(yàn)于2013年5月在河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化基地鹽堿原土鑒定池進(jìn)行。在土壤全鹽含量0.1%的對照池種植30株F2，在土壤全鹽含量0.4%的處理池種植400株F2，待棉花長至1～2葉期時(shí)，隨機(jī)抽取312個(gè)單株進(jìn)行耐鹽鑒定。按照河北省地方標(biāo)準(zhǔn)《棉花耐鹽性鑒定及評價(jià)技術(shù)規(guī)程》中的苗情分類標(biāo)準(zhǔn)(表2)統(tǒng)計(jì)耐鹽與敏鹽單株，鹽害級別為0、1、2級的植株全部記載為耐鹽，3、4級的記載為敏鹽。

1.2.2 DNA提取 利用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的 CottonGenDNAkit提取供試材料DNA，然后用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TU-1810紫外分光光度計(jì)檢測 DNA純度與濃度。

1.2.3 DNA池的構(gòu)建 從NY1×中棉所12的F2分離群體中隨機(jī)選擇耐鹽植株和敏鹽植株各20株，分別提取其基因組DNA并測定其濃度，稀釋后分別按等量混合后構(gòu)建F2耐鹽池和敏鹽池。

1.2.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測 PCR反應(yīng)總體系為20.0 μl，其中10 × Buffer 2.0 μl，10 mmol/L的 dNTP 0.4 μl，5 U/μl 的 Taq 酶 0.2 μl，30 ng/μl的模板DNA 1.0 μl，正反引物(50 ng/μl)各 0.7 μl，PCR染料 2.0 μl，然后加雙蒸水補(bǔ)齊 20.0 μl。

PCR反應(yīng)在Eppendorf mastercycler gradient基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸10 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)后退火變?yōu)?0℃，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物，在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測帶型。

表2 棉花鹽害級別分類標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The classification of salt injury grade in cotton

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花耐鹽SRAP分子標(biāo)記的篩選

用88對SRAP引物(8個(gè)正向引物和11個(gè)反向引物組成)對2個(gè)棉花親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出清晰穩(wěn)定、具有多態(tài)性條帶的引物6對。然后用這6對引物對F2群體耐、敏基因池進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出1對引物(me3-em5)在耐鹽親本和耐鹽池中均能擴(kuò)增出一條約為350 bp的特異片段，而在敏鹽親本和敏鹽池中未擴(kuò)增出該片段(圖1)。

2.2 棉花耐鹽SRAP分子標(biāo)記在F2分離群體中的鑒定

將篩選到的引物組合me3-em5對F2代中隨機(jī)選取的312株耐、敏鹽單株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，結(jié)果(圖2)顯示，在230株耐鹽單株中有226株能擴(kuò)增出此特異片段，而在82株敏鹽單株中有80株沒有擴(kuò)增出該片段，2株擴(kuò)增出這一片段，可以看出F2代分離群體中出現(xiàn)6個(gè)重組個(gè)體，重組率為1.92%。

2.3 棉花耐鹽SRAP分子標(biāo)記在不同棉花品種中的鑒定

圖1 引物組合me3-em5在棉花兩親本及耐、敏池間的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of cotton parents，salt tolerant and salt sensitive pools with me3-em5

圖2 引物組合me3-em5在F2部分耐、敏鹽單株間的擴(kuò)增Fig.2 Amplification of salt tolerant and salt sensitive F2plants with me3-em5

對22個(gè)耐鹽品種和4個(gè)敏鹽品種進(jìn)行PCR分析，結(jié)果(圖3)顯示，22個(gè)耐鹽品種中20個(gè)品種均擴(kuò)增出350 bp特異條帶，只有中棉所35和邯棉5158擴(kuò)增出的條帶稍有下移接近300 bp，4個(gè)敏鹽品種中均沒有擴(kuò)增出此條帶。除了中棉35和邯棉5158有細(xì)微差別外，其他品種鹽池鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果基本一致。

圖3 引物組合me3-em5在不同材料中的擴(kuò)增Fig.3 Amplification of salt tolerant and sensitive cotton varieties with me3-em5

3 討論

棉花的耐鹽性不但受到棉花本身遺傳因素影響，還受外界環(huán)境及栽培措施的影響，其耐鹽機(jī)制至今還沒形成統(tǒng)一認(rèn)識，很多領(lǐng)域尚存在爭論［29］。沈法富等［10］通過雙列雜交對6個(gè)耐鹽性不同的品種進(jìn)行分析，結(jié)果表明，棉花的耐鹽性存在著加性和顯性效應(yīng)，以加性效應(yīng)為主，耐鹽性呈不完全顯性，受一對主效基因控制。張麗娜等［25］利用SSR技術(shù)對兩個(gè)典型的耐鹽品種和敏鹽品種進(jìn)行了多態(tài)性引物篩選，初步獲得了10對引物，有望成為鑒定棉花耐鹽性的標(biāo)準(zhǔn)引物。

為了減少不同遺傳背景的影響，本研究利用SRAP標(biāo)記技術(shù)和BSA法尋找棉花耐鹽相關(guān)的分子標(biāo)記，共篩選了88對引物，其中有6對引物在兩親本間產(chǎn)生特異帶，且?guī)颓逦€(wěn)定，重復(fù)性較好。然后對篩選出的多態(tài)性引物在F2群體耐鹽池和敏鹽池間擴(kuò)增，1對引物在耐鹽池產(chǎn)生350 bp大小的條帶，而在敏鹽池沒有擴(kuò)增出此條帶，推測該擴(kuò)增產(chǎn)物可能是與棉花耐鹽性連鎖的分子標(biāo)記。對F2分離群體大量單株的擴(kuò)增中，出現(xiàn)了4個(gè)重組個(gè)體，重組率為1.92%，說明該標(biāo)記與耐鹽性不能共分離，但是與耐鹽性連鎖程度較為緊密。通過26個(gè)耐、敏鹽品種(品系)的驗(yàn)證，證實(shí)了4個(gè)敏鹽材料中均沒有擴(kuò)增出該產(chǎn)物，而22個(gè)耐鹽材料中基本上擴(kuò)增了該產(chǎn)物，只是在極個(gè)別材料中發(fā)生了輕微變化，這種現(xiàn)象說明了在不同的材料中，標(biāo)記片段的大小會(huì)發(fā)生改變，這可能是不同的遺傳背景或是不同的環(huán)境條件所致。通過研究，基本可以斷定該片段是與棉花耐鹽性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記。

由于棉花基因組序列很大，一旦獲得與耐鹽性狀緊密連鎖的標(biāo)記，就證明了標(biāo)記的可行性和可用性。本研究首次應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對棉花耐鹽性進(jìn)行遺傳標(biāo)記分析，最終篩選獲得1個(gè)與棉花耐鹽密切相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記，為棉花耐鹽性鑒定提供了一種快速有效的方法，從而促進(jìn)棉花耐鹽性分子標(biāo)記輔助育種的進(jìn)程，也為棉花耐鹽基因的定位、克隆奠定良好的基礎(chǔ)。但是，該研究中只用了一組雜交組合及F2群體為材料，而耐鹽性是一個(gè)比較復(fù)雜的數(shù)量性狀，單一耐鹽、敏鹽親本的選擇，可能會(huì)影響到結(jié)果的準(zhǔn)確性，未來研究應(yīng)該再增加雜交組合數(shù)或建立永久的分離群體，尋找更多與耐鹽性連鎖的分子標(biāo)記，以期準(zhǔn)確定位與棉花耐鹽相關(guān)的QTL。

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