豬源馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白原核表達(dá)及其小鼠免疫保護(hù)力分析

周俊明，何孔旺，倪艷秀，祝昊丹，俞正玉，茅愛華，呂立新，溫立斌，張雪寒，王小敏，汪偉，李彬，郭容利

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014)

摘要：為了原核表達(dá)豬源馬鏈球菌獸疫亞種去除信號肽的類M蛋白質(zhì)，并分析該蛋白質(zhì)對小鼠的免疫保護(hù)力，克隆了馬鏈球菌獸疫亞種CY菌株去除信號肽的類M蛋白質(zhì)基因Szp，并將Szp基因插入pET28a表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)，獲得重組類M蛋白質(zhì)，弗氏佐劑乳化重組類M蛋白質(zhì)后，3次免疫小鼠，用同源菌株CY攻擊。誘導(dǎo)獲得分子量約5.8×10`4的重組蛋白質(zhì)，免疫印跡結(jié)果表明該重組類M蛋白質(zhì)能夠被馬鏈球菌獸疫亞種豬多抗識別。類M蛋白質(zhì)免疫小鼠的存活率為60%，弗氏佐劑乳化滅活CY免疫小鼠的存活率為70%，PBS對照組小鼠攻毒后6 d內(nèi)全部死亡。表達(dá)的類M蛋白質(zhì)可以給予ICR小鼠部分的免疫保護(hù)力，保護(hù)效果略低于CY全菌滅活苗，提示可以對馬鏈球菌獸疫亞種多種免疫保護(hù)性抗原進(jìn)行聯(lián)合，從而進(jìn)一步提高對動物的免疫保護(hù)力。

關(guān)鍵詞：馬鏈球菌獸疫亞種；類M蛋白質(zhì)；原核表達(dá)；疫苗

doi:10.3969/j.issn.1000-4440.2015.03.020

收稿日期：2014-10-08

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(fèi)項目(201303041)；江蘇省自主創(chuàng)新探索性研究項目

作者簡介：周俊明(1983-)，男，江蘇東臺人，碩士，助理研究員，主要研究方向為動物傳染病防治。(Tel)025-84390988;(E-mail)zhoujm075@163.com

中圖分類號：S858.282.61`+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440(2015)03-0590-05

Abstract：An open reading frame encoding M-like protein from strain CY of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus of porcine origin without signal sequence was amplified by PCR using chromosomal DNA of CY as template. Amplicon was inserted into plasmid pET28a and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3). A His-tag fusion protein SzP was then induced with IPTG. Mice were immunized three times with SzP and challenged by the homologous strain CY. The fusion protein SzP with molecular weight about 5.8×10`4 showed the specific immunoreactivity with pig antiserum against strain CY. Six SzP-vaccinated mice survied out of 10 tested mice, and the figure was 7 for whole cell bacterin-vaccinated mice. Meanwhile, the control mice vaccinated with PBS all died 6 days post-infection. It is indicated that the fusion protein SzP delivered certain protection against Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.

Prokaryotic expression of M-like protein fromStreptococcusequisubsp.zooepidemicusof porcine origin and its immunoprotection in mice

ZHOU Jun-ming,HE Kong-wang,NI Yan-xiu,ZHU Hao-dan,YU Zheng-yu,MAO Ai-hua,Lü Li-xin,WEN Li-bin,ZHANG Xue-han,WANG Xiao-min,WANG Wei,LI Bin,GUO Rong-li

(InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnology,MinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products,Nanjing210014,China)

Key words：Streptococcusequisubsp.zooepidemicus;M-like protein;prokaryotic expression;vaccine

馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus,S.zooepidemicus，Sz)是革蘭氏陽性菌，屬于鏈球菌蘭氏分群C群，可感染多種宿主，包括馬、牛、豬、家禽、羊、狗，偶爾也有感染人的病例出現(xiàn)[1-3]。在中國該菌是一種重要的豬病原菌，能引起豬鏈球菌病，臨床表現(xiàn)有敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎。1975年四川省暴發(fā)了豬鏈球菌病，病原即Sz，大量豬發(fā)病死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。劉佩紅等對上海地區(qū)1998年至1999年發(fā)病豬體內(nèi)分離的15株豬鏈球菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)仍以C群鏈球菌為主，并且發(fā)現(xiàn)所分離的鏈球菌對多種抗生素產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，因此可以采取免疫手段控制該菌引起的豬鏈球菌病。

目前國內(nèi)已有多種C群鏈球菌滅活疫苗和弱毒苗，但是效果不佳，所以亟需研制出安全、有效的替代疫苗。Hofman等利用馬鏈球菌馬亞種的類M蛋白質(zhì)，成功地控制了馬腺疫。A群鏈球菌的M蛋白質(zhì)可有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Moore等報道Sz表面有一種耐酸、耐熱的蛋白質(zhì)，類似于A群鏈球菌的M蛋白質(zhì)，故稱該蛋白質(zhì)為類M蛋白質(zhì)(SzP)。Timoney等首次克隆表達(dá)馬源SzW60菌株的SzP，發(fā)現(xiàn)用表達(dá)該蛋白質(zhì)的大腸桿菌裂解物免疫小鼠，能夠提供小鼠部分抵抗W60菌株攻擊的能力；并且在后期研究中，對去除信號肽的SzP進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，發(fā)現(xiàn)純化的SzP對ICR小鼠的免疫保護(hù)力為90%[10]。范紅結(jié)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)分離的8株豬源Sz類M蛋白質(zhì)基因的核苷酸同源性為95.4%～99.9%，與馬源W60株、人源25064株的同源性分別為84.8%～87.0%和89.0%～91.8%，提示豬源Sz的SzP，可能有別于馬源Sz。本試驗通過pET28a載體，表達(dá)豬源馬鏈球菌獸疫亞種CY菌株去除信號肽的SzP，選擇小鼠為研究對象，旨在評估豬源Sz的SzP亞單位疫苗，為SzP亞單位疫苗的進(jìn)一步研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料

馬鏈球菌獸疫亞種菌株CY(分離自發(fā)生敗血癥的病豬體內(nèi))、pET-28a表達(dá)質(zhì)粒、Sz豬抗血清等均由本實驗室保存；THB培養(yǎng)基，購于美國BD公司；BamHⅠ酶、XhoⅠ酶、T4 DNA連接酶、Ex-TaqDNA聚合酶，購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrepTMPlasmid Miniprep kit，購自AXYGen公司；BL21感受態(tài)細(xì)胞、Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、DAB顯色液，購自武漢博士德生物工程有限公司；TMB購自Amersco公司；ELISA板購自Costar公司；Protino Ni-TED 2 000 packed columns，購自MACHEREY-NAGEL公司。

1.2　SzP編碼基因的擴(kuò)增

用THB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株CY，利用煮沸法提取其模板，參照GenBank登錄的馬鏈球菌獸疫亞種CY類M蛋白質(zhì)編碼基因Szp序列AY26599，設(shè)計1對擴(kuò)增Szp基因112～1 152 bp區(qū)域的引物(P1：5′-AAGGATCCGATTCTGTTGAGTCAGCTAA-3′；P2：5′-CCTCTCGAGTTAGTTTTCTTTGCGTCTT-3′)，并分別在兩端添加BamH Ⅰ 和XhoⅠ 酶的酶切位點(引物中下劃線部分)，交由上海立菲生物技術(shù)公司進(jìn)行合成。利用合成的上下游引物對Szp基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用DNA凝膠回收試劑盒回收Szp片段。

1.3　pET28a- Szp重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將回收的Szp片段和pET28a質(zhì)粒，分別用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切；在T4 DNA連接酶作用下，將雙酶切后的Szp片段和pET28a于4 ℃連接16 h，再轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)BL21；將轉(zhuǎn)化的BL21細(xì)菌平鋪于含卡那霉素(30 μg/ml)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上的菌落，接種于含卡那霉素(30 μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，提取重組細(xì)菌的質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Szp，送至上海立菲生物技術(shù)公司進(jìn)行測序鑒定。

1.4　陽性重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

利用含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有pET28a-Szp的重組菌，振蕩培養(yǎng)(220 r/min)，至OD600值達(dá)到0.4～0.6時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h。

1.5　SzP重組蛋白質(zhì)的純化

收集誘導(dǎo)后的菌液，離心獲取菌體沉淀，參照Protino Ni-TED蛋白質(zhì)純化手冊，進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的純化。利用RC DC Protein Assay試劑盒(美國BioRad公司產(chǎn)品)，測定純化蛋白質(zhì)濃度。

1.6　SzP融合表達(dá)蛋白質(zhì)的Western-blot分析

參照文獻(xiàn)[12]，將pET28a-Szp陽性重組菌誘導(dǎo)前、后的菌液分別進(jìn)行離心，PBS重懸菌體后，沸水浴10 min，離心取上清；聯(lián)合純化的SzP重組蛋白質(zhì)，共3份樣品，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，1%脫脂奶封閉PVDF膜；將Sz豬陽性血清稀釋1 000倍作為一抗， HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG稀釋5 000倍作為二抗，DAB顯色，雙蒸水終止反應(yīng)。

1.7　重組蛋白質(zhì)免疫小鼠保護(hù)力分析

30只清潔級6周齡ICR雌性小鼠(購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心)隨機(jī)分為3組，每組10只，依次皮下注射SzP重組蛋白質(zhì)、CY全菌滅活苗和PBS，其中SzP亞單位疫苗用量為每只40 μg，CY全菌滅活苗用量為每只108CFU。首免時對免疫物添加弗氏完全佐劑乳化，隨后進(jìn)行2次免疫弗氏不完全佐劑乳化的免疫物，免疫間隔14 d。末次免疫后14 d，用CY菌株腹腔注射小鼠，接種劑量為5×107CFU。攻毒后連續(xù)觀察10 d。

2結(jié)果

2.1　馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白質(zhì)基因的擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，顯示1條1 000 bp左右的條帶(圖1)，大小與預(yù)期一致。

1、2：Szp的PCR擴(kuò)增片段；M：DL-2 000 marker。 圖1　Szp基因的PCR擴(kuò)增 Fig.1　The PCR amplification of Szp gene

2.2　pET28a- Szp重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

構(gòu)建的pET28a-Szp重組質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到約5 000 bp及1 000 bp左右的條帶(圖2)，表明擴(kuò)增的Szp基因片段已經(jīng)插入到pET28a質(zhì)粒中。

1：pET28a-Szp的BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切；M：DL-15 000 marker。 圖2　重組質(zhì)粒pET28a-Szp的酶切鑒定 Fig.2　Restriction endonuclease identification of recombinant expression plasmid pET28a-Szp

測序結(jié)果顯示克隆進(jìn)入pET28a載體的Szp基因長度為1 041 bp，與已發(fā)表的CY菌株Szp基因存在1個堿基的錯配，致使307位堿基由G突變?yōu)锳，編碼氨基酸密碼子由GCA(丙氨酸Ala)突變?yōu)锳CA(蘇氨酸Thr)，未形成終止密碼子。

2.3　SzP重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)、純化及Western-blot分析

陽性重組菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)3 h后，獲得分子量約5.8×104的SzP重組蛋白質(zhì)。經(jīng)過Ni柱親和層析后，獲得單一的SzP重組蛋白質(zhì)。利用馬鏈球菌獸疫亞種豬抗血清，用Western-blot法檢測到5.8×104的SzP重組蛋白質(zhì)(圖3)。

1： Ni柱純化的SzP重組蛋白質(zhì)；2：pET28a-Szp陽性重組菌粒誘導(dǎo)后；3：pET28a-Szp陽性重組菌誘導(dǎo)前；M：蛋白質(zhì)Marker。 圖3　SzP重組蛋白質(zhì)純化(A)及Western-blot分析(B) Fig.3　Purification(A) and Western-blot(B) of the recombinant protein SzP

2.4　小鼠免疫保護(hù)試驗

小鼠攻毒后，對照組小鼠2 d內(nèi)死亡率達(dá)到60%，免疫組小鼠攻毒后4 d存活率維持在90%，之后陸續(xù)出現(xiàn)死亡。發(fā)病較重的小鼠臨床表現(xiàn)被毛粗立、精神沉郁、行動遲緩。在死亡小鼠肝臟中能夠分離到馬鏈球菌獸疫亞種菌株。SzP重組蛋白質(zhì)對小鼠的保護(hù)率為60%(6/10)，CY滅活疫苗對小鼠的保護(hù)率為70%，PBS對照組小鼠全部死亡(圖4)。

圖4　免疫小鼠攻毒后的存活率 Fig.4　The survival rates of the immunized mice post-infection

3討論

馬鏈球菌獸疫亞種是引發(fā)豬鏈球菌病的一種重要病原菌。范紅結(jié)等按馬源獸疫亞種W60菌株的SzP編碼基因設(shè)計引物，擴(kuò)增了豬源馬鏈球菌獸疫亞種35246菌株的SzP編碼基因，該段基因包含了SzP的信號肽編碼序列，隨后擴(kuò)增的基因片段插入pET32a載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，未能獲得重組SzP[13]。2011年Lin等利用豬痘病毒載體，表達(dá)了35246菌株去除信號肽的SzP，并通過小鼠免疫試驗，發(fā)現(xiàn)該重組SzP對小鼠有70%免疫保護(hù)力[14]。Timoney等利用原核表達(dá)載體pET15b，表達(dá)了馬源SzNC78菌株去除信號肽的SzP，并利用純化的SzP免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)90%受免小鼠可以抵抗NC78的攻擊。

本研究首次對豬源Sz去除信號肽的類M蛋白質(zhì)進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，獲得分子量約5.8×104的重組蛋白質(zhì)，明顯高于推測的重組蛋白質(zhì)分子量3.7×104。對插入pET28載體的Szp基因序列測序，發(fā)現(xiàn)推導(dǎo)的重組蛋白質(zhì)C端LPSTGE上游存在11個重復(fù)PEPK，推測由于該部分富含脯氨酸，造成蛋白質(zhì)遷移率下降，出現(xiàn)表達(dá)的重組SzP蛋白質(zhì)表觀分子量大于理論分子量的現(xiàn)象，該結(jié)果與Timoney等觀察到的結(jié)果一致。

SzP能抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用，有利于細(xì)菌在動物體內(nèi)的生存和繁殖。針對SzP的抗體，具備調(diào)理素作用，可增強(qiáng)C3b在細(xì)菌表面的沉積[15]，并且中和SzP下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF、TLR6的能力[16]。本研究對純化的SzP進(jìn)行小鼠免疫保護(hù)力分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)3次免疫小鼠后，對小鼠的免疫保護(hù)率為60%，略低于Sz滅活疫苗的保護(hù)率，與痘病毒表達(dá)的類M蛋白質(zhì)保護(hù)率相當(dāng)[14]。豬源Sz的類M蛋白質(zhì)對小鼠的免疫保護(hù)率，比馬源Sz類M蛋白質(zhì)的保護(hù)率低，一方面與Sz菌株分離來源不同相關(guān)，不同地域和不同宿主分離的Sz菌株可能會存在致病力上的差異，另一方面類M蛋白質(zhì)編碼基因在豬源Sz和馬源Sz之間存在一定差異，從而引起不同的免疫保護(hù)表現(xiàn)。Timoney等利用基因文庫，從馬源SzNC78菌株中篩選獲得一系列免疫原性蛋白質(zhì)，對其中11種蛋白質(zhì)進(jìn)行了表達(dá)、純化，并分析了這些蛋白質(zhì)對ICR小鼠的免疫保護(hù)力，發(fā)現(xiàn)M蛋白質(zhì)(SzM)、膜錨定蛋白質(zhì)(MAP)和絲氨酸蛋白酶(ScpC)組合形成的三價疫苗，與單組份亞單位疫苗相比較，可提高10倍小鼠耐受的攻毒劑量。另外，Timoney等還提出，ScpC、SzM和鏈激酶(SKC)組合形成的亞單位疫苗，理論上可以減輕Sz對肺臟的損傷。盡管上述具備良好免疫保護(hù)力的蛋白質(zhì)是在研究馬源Sz的基礎(chǔ)上獲得的，但是馬源Sz和豬源Sz細(xì)菌在分類上歸屬同一種，僅僅是細(xì)菌分離的宿主不同，所以，對豬源Sz中類似蛋白質(zhì)進(jìn)行組合研究，或許可以補(bǔ)充單組份亞單位疫苗的不足，對控制Sz引發(fā)的豬鏈球菌病有積極作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]BERES S B, SESSO R, PINTO S W, et al. Genome sequence of a Lancefield group CStreptococcuszooepidemicusstrain causing epidemic nephritis: new information about an old disease . PLOS One, 2008, 3(8):e3026.

[2]EYRE D W, KENKRE J S, BOWLER I C, et al.Streptococcusequisubspecieszooepidemicusmeningitis--a case report and review of the literature . Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2010, 29(12):1459-1463.

[3]MORI N, GUEVARA J M, TILLEY D H, et al.Streptococcusequisubsp.zooepidemicusmeningitis in Peru . J Med Microbiol, 2013, 62( 2):335-337.

[4]LIU P H, SHUN S F, WANG Y K, et al. Identification of swineStreptococcusisolates in Shanghai . Chin J Vet Med, 2001, 21(1):42-46.

[5]FENG Z G, HU J S. Outbreak of swine streptococcosis in Sichuan province and identification of pathogen . Anim Husbandry Vet Med Lett, 1977, 2:7-12.

[6]HOFMAN A M, STAEMPFLI H R, PRESCOTT J F. Field-evaluation of a commercial M-protein vaccine againstStreptococcus-equiinfection in foals . Amer J Vet Res, 1991, 52(4):589-592.

[7]ROBINSON J H, KEHOE M A. Group-AStreptococcal-M proteins virulence factors and protective antigens . Immunol Today, 1992, 13(9):362-366.

[8]MOORE B O, BRYANS J T. Antigenic classification of group C animal streptococci . J Am Vet Med Assoc, 1969, 155(2): 416-421.

[9]TIMONEY J F, WALKER J, ZHOU M, et al. Cloning and sequence analysis of a protective M-like protein gene fromStreptococcusequisubsp.zooepidemicus. Infect Immun, 1995, 63(4): 1440-1445.

[10]VELINENI S, TIMONEY J F. Identification of novel immunoreactive proteins ofStreptococcuszooepidemicuswith potential as vaccine components . Vaccine, 2013, 31(38): 4129-4135.

[11]范紅結(jié)，陸承平，唐家琪. 豬源馬鏈球菌獸疫亞種中國分離株類M基因特性分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006, 39(1):210-214.

[12]汪家政,范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊. 北京：科學(xué)出版社, 2000.

[13]范紅結(jié)，陸承平，唐家琪. 馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的基因克隆、序列分析及其在豬源鏈球菌的檢測. 微生物學(xué)報，2004, 44(5):617-620.

[14]LIN H X, HUANG D Y, WANG Y, et al. A novel vaccine againstStreptococcusequissp.zooepidemicusinfections: The recombinant swinepox virus expressing M-like protein . Vaccine, 2011, 29(40): 7027-7034.

[15]MA Z, ZHANG H, YI L, et al. Interaction between M-like protein and macrophage thioredoxin facilitates antiphagocytosis forStreptococcusequisubsp.zooepidemicus. PLoS ONE, 2012, 7(2):e32099.

[16]MA Z, ZHANG H, YI L, et al. Microarray analysis of the effect ofStreptococcusequisubsp.zooepidemicusM-like protein in infecting procine pulmonary alveolar macrophages . Plos One, 2012, 7(5):e36452.

(責(zé)任編輯：張震林)

王金玲，王永，劉魯蜀，等. 草地藏系綿羊生長激素釋放激素基因部分cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31(3)：595-599.