王金玲， 王 永， 劉魯蜀， 陶永平

(1.綿陽師范學(xué)院，四川 綿陽 621000;2.西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610041;3.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041;4.四川省若爾蓋縣畜牧局，四川 若爾蓋 624500)

動物生長是一個復(fù)雜的生物代謝過程，這個過 程受基因型、激素、營養(yǎng)和環(huán)境等因素的共同影響。激素作為生物體內(nèi)的一種化學(xué)信息，對機(jī)體的生長發(fā)育、代謝、繁殖和衰老等生命過程起著重要的調(diào)控作用。神經(jīng)內(nèi)分泌生長軸，又稱腦垂體生長軸，在動物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。下丘腦分泌的生長抑素(Somatostatin，SS)和生長激素釋放激素(Growth hormone releasing hormone，GHRH)、垂體分泌的生長激素(Growth hormone，GH)、調(diào)節(jié)靶器官(如肝臟)分泌的生長激素受體(Growth hormone receptor，GHR)如胰島素樣生長因子(Insulinlike growth factor-I，IGF-I)等構(gòu)成了動物下丘腦-垂體-靶器官作用通路的基本內(nèi)容［1］。

作為垂體生長激素(Growth hormone，GH)的正向調(diào)控因子，GHRH能促進(jìn)垂體合成和分泌生長激素GH［2］。目前，已有多例關(guān)于GHRH基因克隆的報道。Meng等［3］構(gòu)建了羊生長激素釋放激素的肌肉注射表達(dá)質(zhì)粒，通過一次性簡單肌肉注射這種質(zhì)?？梢蕴岣哐虻纳L速度，促進(jìn)體質(zhì)量增加。汪以真等［4］用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)對豬下丘腦促生長激素釋放激素(GHRH)cDNA擴(kuò)增，得到豬GHRH基因cDNA編碼區(qū)序列。Kazmer等［5］對普通牛GHRH全基因測序得到全長9 356 bp的片段。歐江濤等［6］對牦牛GHRH基因進(jìn)行PCR產(chǎn)物T-A克隆測序。馬志杰［7］等克隆了歐拉型藏羊GHRH基因內(nèi)含子2的部分序列并進(jìn)行了HaeIII-RFLP分析。另外，人、金地鼠、豬、馬、雞、南方鲇魚、斑馬魚等物種的 GHRH基因也相繼得到克隆［8-9］。藏系綿羊是我國青藏高原特有的畜種之一，也是中國粗毛羊中的一個地方原始品種，具有耐高寒、耐粗飼料、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)［10］。國內(nèi)一些學(xué)者對其已有較為系統(tǒng)的研究，但多數(shù)集中于傳統(tǒng)生物學(xué)及遺傳多樣性方面［11-13］。草地藏系綿羊 GHRH基因的cDNA克隆還未見報道。

本研究以草地藏系綿羊生長激素釋放激素基因(GHRH)作為研究目標(biāo)，通過組織提取RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行克隆、測序并對其核苷酸序列進(jìn)行比較分析，為進(jìn)一步從分子水平上闡明草地藏系綿羊生長特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及樣品采集

提取總RNA所用的成年藏系綿羊的下丘腦組織采自四川省阿壩藏族自治州若爾蓋縣，屠宰后30 min內(nèi)采集3頭藏系綿羊的下丘腦組織，迅速放入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Trizol，TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker，pMD18-T Vector，IPTG，X-gal，膠回收(小量)試劑盒。

1.3 藏系綿羊下丘腦組織總RNA的提取和檢測

采用Trizol試劑提取下丘腦組織總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測所獲得的RNA。用紫外分光光度計分析RNA濃度和質(zhì)量。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中普通牛的基因(NCBI Genbank登陸號:NM178325)，應(yīng)用primer5.0軟件設(shè)計引物，該引物為:上游引物:5'-GCTAAGTGTCTACAGCCTTGCAG-3'，下 游 引 物:5'-CAGCCCTTATCACTCTCTGGA-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段長度340 bp。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.5 藏系綿羊GHRH基因的RT-PCR

RT-PCR 反應(yīng)體系:反應(yīng)總體積10.00 μl，MgCl2(25 mmol/L)2.00 μl，10 × RT-Buffer 1 μl，dNTP(10 mmol/L)1 μl，RNase free dH2O 2.75 μl，RNase Inhibitor(40 U/μl)0.25μl，AMV(5 U/μl)0.50 μl，Oliglt dT-Adaptor Primer(2.5 U/μl)0.50 μl，RNA樣品2.00 μl。RT-PCR反應(yīng)條件:50℃ 30 min;99℃ 5 min;5℃ 5 min，所獲得的cDNA在4℃下保存。

PCR反應(yīng)體系:反應(yīng)總體積為40 μl:5×Buffer 10.00 μl，滅菌水23.75 μl，Ex Taq HS(5 U/μl)0.25 μl，上 游 引 物 (20 pmol/L)0.50 μl，下 游 引 物 (20 pmol/L)0.50 μl，cDNA 5.00 μl。PCR 反應(yīng)條件:95℃ 2 min;95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 10 s，30個循環(huán);72℃ 4 min，4℃保存。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成相系統(tǒng)拍照檢測。

1.6 藏系綿羊GHRH基因擴(kuò)增片段的克隆測序

PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶經(jīng)割膠并回收純化，取1.5 μl加入到0.5 μl載體 PMD-18 Vector中，然后加入 SolutionⅠ 5.0 μl，滅菌水 3.0 μl，混勻，反應(yīng)總體積 10.00 μl，16 ℃水浴 3 h。將10 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到200 μl E.coli.JM109 感受態(tài)宿主菌中。取100 μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在含氨芐、IPTG和X-Gal LB平板上，挑取白色菌斑培養(yǎng)，同時用未轉(zhuǎn)化的菌液作陰性對照。用試劑盒抽提質(zhì)粒，送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 藏系綿羊下丘腦總RNA的提取

對提取的藏系綿羊下丘腦總RNA樣品進(jìn)行測定，其中1號樣品 RNA OD260=0.231，OD280=0.132，OD260/OD280=1.750;2號樣品 RNA OD260=0.220，OD280=0.132，OD260/OD280=1.667。電泳分析顯示，用Trizol試劑提取的藏系綿羊下丘腦總RNA的28S和18S條帶清楚，可用于RT-PCR(圖1)。

圖1 草地藏系綿羊下丘腦組織總RNA瓊脂糖電泳圖Fig.1 Total RNA from Tibetan sheep hypothalamus revealed by agarose gel electrophoresis

2.2 藏系綿羊GHRH基因RT-PCR

因未見報道綿羊GHRH基因mRNA的CDS全序列，故根據(jù)普通牛GHRH基因序列設(shè)計的引物期望能很好地擴(kuò)增出藏系綿羊GHRH基因，獲得的基因目的片段為200 bp左右，沒有雜帶(圖2)。

圖2 草地藏系綿羊下丘腦組織GHRH基因RT-PCR瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.2 GHRH cDNA from Tibetan sheep hypothalamus by RT-PCR

2.3 藏系綿羊下丘腦組織GHRH基因重組子PCR結(jié)果

用重組子PMD18-T Vecter-GHRH轉(zhuǎn)化后的重組子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定目的片段是否已經(jīng)連接到載體上，并用未轉(zhuǎn)化的重組子做陰性對照，結(jié)果如圖3。

圖3 草地藏系綿羊下丘腦組織GHRH基因重組子PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳鑒定結(jié)果Fig.3 Ⅰdentification of GHRH cDNA from Tibetan sheep hypothalamus by PCR

2.4 藏系綿羊下丘腦組織GHRH基因測序結(jié)果及生物信息學(xué)分析

將連接到載體上的目的片段進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，目的cDNA片段全長207 bp，編碼了69個氨基酸殘基。cDNA片段的序列為:5'-ATGCTGCTCT GGGTGTTCTTCCTCGTGACCCTCACCCTCAGCAGCGGCTCCCAAGGTTCCCTGCCCTCCCAGCCTCTCAGGATCCCAAGGTACGCAGATGCCATCTTCACTAACAGCTACCGGAAGATTCTGGGCCAGCTGTCTGCCCGCAAGCTACTCCAGGATATCATGAACAGGCAGCAGGGAGAGAGAAACCAGGAGCAAGGAA-3'。氨基酸殘基序列分別為:MLLWVFFLVTLTLSSGSQGSLPSQPLRIPRYADAI FTNSYRKILGQLSARKLLQDIMNRQQGERNQEQG

2.4.1 草地藏系綿羊與綿羊生長激素釋放激素基因(GHRH)部分序列比較 通過NCBI中的Blast程序分析，將草地藏系綿羊GHRH基因部分片段測序結(jié)果與GenBank中注冊的綿羊GHRH基因(XM_004014558)相應(yīng)序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果(圖4)表明，草地藏系綿羊編碼起始位置(86位)到292位區(qū)域與綿羊的該段序列間高度同源，共發(fā)現(xiàn)1處序列堿基差異，為1次堿基顛換(即A—C顛換)。

2.4.2 草地藏系綿羊生長激素釋放激素基因(GH-RH)部分序列編碼的氨基酸序列分析 通過Vectoer-NT1軟件分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA片段編碼的氨基酸殘基序列與其比對基因序列所編碼的部分氨基酸序列一致，這里體現(xiàn)了密碼子的簡并性。

對所得氨基酸殘基序列進(jìn)行信號肽預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)域存在信號肽，可推測若獲得完整的CDS框編碼的蛋白應(yīng)屬于分泌蛋白，且剪切位點(diǎn)位于第20個氨基酸殘基位置(圖5)。利用SMART程序?qū)ν茖?dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域在線分析，表明在該序列的31～57位具有典型的 GLUCA結(jié)構(gòu)域(圖6)，GLUCA具有典型的胰高血糖素類似激素的特征。

圖4 利用Blast程序所預(yù)測的草地藏系綿羊GHRH基因核苷酸序列與綿羊GHRH基因(XM_004014558)的同源性比較Fig.4 The alignment of the nucleotide sequence of GHRH gene from Tibetan sheep and the putative GHRH gene from sheep(XM_004014558)

圖5 草地藏系綿羊GHRH基因編碼的氨基酸殘基序列中含有信號肽Fig.5 The signal peptide in the predicted amino acid residues

3 討論

本試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，根據(jù)已報道的牛GHRH基因cDNA序列設(shè)計引物(在本試驗(yàn)設(shè)計之初還未見GenBank中注冊綿羊GHRH基因cDNA全序列)，首次從草地藏系綿羊下丘腦中克隆了GHRH基因部分cDNA，長度為207 bp。通過Blast比較分析發(fā)現(xiàn)，草地藏系綿羊與已報道普通綿羊GHRH cDNA序列間僅有1個堿基的差異，與普通牛序列也只有5個堿基的差異;將草地藏系綿羊GHRH基因部分片段與GenBank中登陸的人、鼠、馬、豬、黑猩猩等物種GHRH基因cDNA成熟肽編碼區(qū)序列進(jìn)行比較。人與黑猩猩間GHRH基因的同源性為99.56%;黑猩猩和金地鼠間GHRH基因同源性為78.26%;草地藏系綿羊GHRH基因部分cDNA與人和黑猩猩的同源性為96.62%，與豬和金地鼠的同源性97.1%，與馬的同源性為98.1%?？梢?，GHRH基因在物種內(nèi)品種間和近緣種間有較高的同源性，而在關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間也存在變異。關(guān)于GHRH氨基酸序列比對的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其無論是在種內(nèi)還是種間都是高度保守的。一系列的Blast比較分析結(jié)果表明，GHRH基因在物種間和物種內(nèi)既存在保守性也存在變異性，反映了其在起源進(jìn)化過程中的一些特點(diǎn)。

圖6 利用SMART程序推導(dǎo)出草地藏系綿羊GHRH基因編碼的氨基酸序列含有GLUCA結(jié)構(gòu)域Fig.6 The deduced GLUCA domain in amino acid sequence using SMART program

對草地藏系綿羊經(jīng)濟(jì)性狀功能基因的研究，目前還處于剛起步階段。同時，鑒于GHRH基因在影響動物生長發(fā)育速度、瘦肉率等方面具有重要作用，本研究認(rèn)為，還應(yīng)對草地藏系綿羊GHRH基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控和定位等方面做大量的分析研究。草地藏系綿羊GHRH基因的部分cDNA序列的獲得，為我們進(jìn)一步對該基因cDNA全長的克隆奠定了基礎(chǔ)，今后計劃通過3'-RACE和5'-RACE技術(shù)獲得草地藏系綿羊GHRH基因cDNA全長序列，進(jìn)而研究其功能。

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