李 悅，何 華，肖得力，朱鳴陽(yáng)

(1．天津醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)系，天津 300222;2．中國(guó)藥科大學(xué) 分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 211198)

黃酮類化合物是天然藥物中的重要組分，其抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗過敏的生物活性和藥理學(xué)作用對(duì)于新藥研發(fā)中的靶點(diǎn)選擇、先導(dǎo)物活性篩選、臨床藥理研究等過程具有重大意義［1－3］。楊梅素(3，3’，4’，5，5’，7-六羥基黃酮，Myricetin，MYR，結(jié)構(gòu)式見圖1)屬于天然黃酮醇類活性成分，源自楊梅科楊梅屬植物楊梅(Myrica rubra(Lour.)Sieb.et Zucc.)樹葉、皮、根的提取物，作為抗氧化劑表現(xiàn)出良好的自由基清除能力［4］。除抗氧化、降低神經(jīng)毒性、拮抗血小板活化因子、降低血糖、降血脂以及保護(hù)肝臟的功能外，楊梅素還能通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)RIN－m5F β細(xì)胞凋亡，表達(dá)出一定的抗腫瘤、抗基因突變活性［5－7］。美國(guó)保健品藥FYI使用楊梅素治療預(yù)防關(guān)節(jié)炎和各種炎癥，尤其適用于懷孕婦女和哺乳期嬰兒。

許多抗腫瘤藥物在細(xì)胞內(nèi)均以DNA作為靶向［8－9］，通過與癌細(xì)胞的DNA發(fā)生相互作用破壞其雙螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響基因調(diào)控與表達(dá)功能，抑制DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。探索小分子藥物與DNA的作用機(jī)制，有助于進(jìn)一步研究抗腫瘤藥物在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)過程，為藥物篩選提供相關(guān)信息。藥物與DNA不同作用模式的研究結(jié)果可用于設(shè)計(jì)新型有效藥物并有助于研究DNA的結(jié)構(gòu)，具有一定的研究?jī)r(jià)值和實(shí)際意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮醇類活性成分槲皮素、木犀草素、芹菜素等能通過與DNA發(fā)生嵌插結(jié)合，改變堿基對(duì)的結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［10－12］。楊梅素的B環(huán)具有3個(gè)醇羥基，較上述幾種藥物多。化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異是否會(huì)對(duì)藥物與DNA結(jié)合模式產(chǎn)生影響有待于進(jìn)一步研究和探索。

本文采用紫外光譜法、熒光光譜法、圓二色譜法(CD)以及分子模擬共同研究了楊梅素與ct-DNA的相互作用模式、結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合常數(shù)、猝滅常數(shù)、分子間作用力和結(jié)合距離等作用機(jī)制。為進(jìn)一步理解黃酮醇類活性成分的結(jié)構(gòu)與抗腫瘤作用機(jī)理提供了依據(jù)，為合理改善藥效和設(shè)計(jì)研發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于從分子水平上研究藥物小分子與DNA相互作用的機(jī)制具有重要意義。

圖1 楊梅素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of myricetin(MYR)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF－5301 PC熒光分光光度計(jì)、UV 2100型紫外－可見分光光度計(jì)(日本島津公司);PHS－25型酸度計(jì)(上海第二分析儀器廠)。

三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海精細(xì)化工試劑有限公司);小牛胸腺DNA(ct-DNA，Sigma公司)用pH 7.4的Tris－HCl緩沖液(含0.1 mol·L－1NaCl)溶解，濃度通過260 nm處的紫外吸收確定，DNA在260 nm處的吸光系數(shù)為6 600 mol－1·cm－1，于4℃保存;楊梅素(南京澤朗生物科技有限公司)用pH 7.4的Tris－HCl緩沖液配成4.6×10－4mol·L－1儲(chǔ)備液備用;實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外－可見吸收光譜法 于10 mL比色管中依次加入1.0 mL的Tris－HCl緩沖溶液(pH 7.4)、1.0 mL 4.6×10－5mol·L－1楊梅素溶液和不同體積的ct-DNA儲(chǔ)備液，稀釋至刻度后搖勻，室溫放置10 min。以相應(yīng)濃度的ct-DNA與Tris－HCl的混合溶液為參比，于UV－Vis分光光度計(jì)上掃描楊梅素在240～440 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，狹縫寬度為1.0 nm。

1.2.2 熒光光譜法 取3 mL 4.6×10－6mol·L－1楊梅素溶液于石英吸收池中，用微量注射器逐次加入濃度為1.1×10－4mol·L－1的ct-DNA溶液進(jìn)行滴定，加樣體積由實(shí)驗(yàn)點(diǎn)濃度計(jì)算確定(滴定劑累加體積小于100 μL)。以360 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，繪制500～600 nm波長(zhǎng)范圍的熒光光譜。

1.2.3 圓二色譜法 移取一定量的ct-DNA溶液和楊梅素溶液于10 mL比色管中，以Tris－HCl緩沖液定容。使用1 mm石英池，于室溫下測(cè)定220～320 nm范圍內(nèi)ct-DNA與楊梅素發(fā)生相互作用前后的CD譜。

1.2.4 熱變性效應(yīng) 將ct-DNA在沸水浴中加熱15 min后，迅速放入冰水浴中冷卻10 min，制成熱變性DNA。按照“1.2.2”實(shí)驗(yàn)步驟，在同樣濃度范圍內(nèi)，測(cè)定變性DNA和天然雙鏈DNA在上述溶液中的熒光光譜。

1.2.5 分子模擬研究 DNA序列d(CGCGAATTCGCG)雙鏈結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)提供(PDBid:1BNA)，通過Auto Dock Tools軟件平臺(tái)建立受體DNA和配體楊梅素的模型。DNA格點(diǎn)坐標(biāo)設(shè)置為X×Y×Z=106×100×76，格點(diǎn)間距為0.375，格點(diǎn)中心距離設(shè)置為X軸14.719，Y軸20.979，Z軸8.824。運(yùn)用Auto Grid 4程序計(jì)算格點(diǎn)中的相關(guān)能量，Auto Dock 4程序?qū)蠲匪嘏cDNA分子對(duì)接，采用拉馬克遺傳算法探索配體全范圍的柔性構(gòu)象和受體的局部柔性，充分搜索構(gòu)象空間，并以結(jié)合能量最低的結(jié)構(gòu)作為相互作用的最優(yōu)模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 ct-DNA與楊梅素相互作用的吸收光譜

紫外－可見吸收光譜能夠簡(jiǎn)單而有效地檢測(cè)出藥物與DNA的結(jié)合情況。當(dāng)小分子和DNA相互作用并形成新的復(fù)合物時(shí)，通常伴有吸收強(qiáng)度和吸收帶位置的變化［13］。不同濃度ct-DNA對(duì)楊梅素紫外光譜的影響見圖2。楊梅素的濃度為4.6×10－6mol·L－1，最大吸收波長(zhǎng)位于370 nm，隨著ct-DNA濃度的增加，紫外光譜有明顯的減色現(xiàn)象，表明楊梅素與DNA發(fā)生了相互作用，兩者的結(jié)合方式可能為溝槽結(jié)合［14］。同時(shí)紫外光譜未伴隨有最大吸收波長(zhǎng)位置的移動(dòng)，顯示兩者的結(jié)合形式為非嵌插作用［15］。

圖2 ct-DNA對(duì)楊梅素紫外吸收光譜的影響Fig.2 UV－Vis absorption spectra of MYR in the absence and presence of ct-DNA

2.2 熒光光譜法

2.2.1 ct-DNA對(duì)楊梅素的熒光猝滅 熒光猝滅機(jī)制的研究可為考察楊梅素與ct-DNA的相互作用模式提供重要的理論依據(jù)。298 K條件下向楊梅素中加入ct-DNA后，楊梅素的熒光強(qiáng)度依次降低(圖3)，說明ct-DNA可使楊梅素的固有熒光猝滅，證實(shí)了ct-DNA與楊梅素能發(fā)生相互作用。利用Stern－Volmer方程對(duì)熒光猝滅現(xiàn)象進(jìn)行分析:

式中，F(xiàn)0和F分別為ct-DNA不存在和存在時(shí)楊梅素的熒光強(qiáng)度，［Q］為ct-DNA的濃度，Kq為雙分子碰撞猝滅常數(shù)，Ksv為Stern－Volmer猝滅常數(shù)，τ0為ct-DNA不存在時(shí)熒光分子的平均壽命。以F0/F對(duì)［Q］作圖，得到室溫下ct-DNA對(duì)楊梅素?zé)晒忖绲腟tern－Volmer曲線(圖3插圖)為一直線，r2=0.998。

從表1中可以得到Kq值(Kq=Ksv×108)數(shù)量級(jí)為1011，遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol－1·s－1，且猝滅速率常數(shù)隨溫度的升高而降低，說明ct-DNA對(duì)楊梅素的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。表1中，不同溫度下的Ksv值與大多數(shù)溝槽結(jié)合模型的Ksv值一致［16］，明顯低于常見嵌插結(jié)合試劑的Ksv值，如溴化乙錠(EB)的Ksv為1.3×104mol－1。說明楊梅素與DNA結(jié)合的親和力與嵌插結(jié)合相比較低，進(jìn)一步證明兩者間的結(jié)合模式為溝槽結(jié)合［17］。

圖3 ct-DNA對(duì)楊梅素?zé)晒夤庾V的影響Fig.3 Fluorescence spectra of MYR in the presence of varying concentrations of ct-DNA

ct-DNA與楊梅素相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)能夠?yàn)槠渥饔脵C(jī)制的研究提供非常關(guān)鍵的信息，依據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的相關(guān)理論可知，藥物與DNA的結(jié)合常數(shù)越大，說明其在靶細(xì)胞處發(fā)揮藥效的可能性越大，而結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定有助于結(jié)合模式的判斷。表1顯示結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而降低，說明溫度是影響結(jié)合能力的有力因素。Ka值低于典型的嵌插結(jié)合模型中的結(jié)合常數(shù)，進(jìn)一步證明其溝槽結(jié)合的可能性［18］。

表1 楊梅素－DNA體系的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 1 Stern－Volmer quenching constant and binding constant Ka，number of binding sites n of MYR －DNA system

2.2.2 楊梅素與MB競(jìng)爭(zhēng)ct-DNA結(jié)合位點(diǎn)的研究 亞甲基藍(lán)(MB)是一種常見的DNA嵌插結(jié)合劑，故常用作熒光探針來研究藥物與雙鏈DNA的結(jié)合機(jī)制［19］。圖4A顯示，通過嵌插結(jié)合，MB自身的熒光強(qiáng)度和最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生明顯改變，DNA能夠猝滅MB的熒光強(qiáng)度(從450降至140)，同時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)藍(lán)移(從690～673 nm)，說明兩者結(jié)合生成了復(fù)合物。如果楊梅素也能通過嵌插作用與DNA結(jié)合，將會(huì)與MB共同競(jìng)爭(zhēng)DNA上的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致MB－DNA復(fù)合體系的熒光強(qiáng)度顯著下降［20］。圖4B為室溫條件下，楊梅素甲醇溶液滴定MB－DNA體系的熒光光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著楊梅素甲醇溶液濃度的增加，MB－DNA體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(從240升至270)，并發(fā)生紅移(從692 nm移至694 nm)，說明楊梅素未能將MB置換出復(fù)合體系，兩者未形成競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，而是與MB－DNA形成新的三元體系，進(jìn)一步證明楊梅素與DNA的結(jié)合方式不同于MB的嵌插結(jié)合。

圖4 ct-DNA對(duì)MB熒光光譜的影響(A)以及楊梅素甲醇溶液滴定MB－ct-DNA體系的熒光光譜(B)Fig.4 Effect of ct-DNA on fluorescence spectra of MB(A)and fluorescence spectra of MB－ct-DNA complexes in the presence of different concentrations of MYR(B)

2.2.3 熱力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 小分子和生物大分子之間的主要結(jié)合力可通過焓變(ΔH)、熵變(ΔS)進(jìn)行判斷。從熱力學(xué)角度，ΔH＞0，ΔS＞0，說明結(jié)合力為疏水作用;ΔH＜0，ΔS＜0為范德華力和氫鍵力;ΔH＜0，ΔS＞0為靜電力［21］。如果溫度變化很小，焓變可被視為常數(shù)，其值和熵變可由van’t Hoff方程計(jì)算:

式中，Ka為對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為氣體常數(shù)。由上式可知，以lnKa(y)對(duì)1/T(x)作圖，其線性方程為y=3 362x－3.751，r2=0.999。由斜率和截距分別可以計(jì)算出焓變?chǔ)、熵變?chǔ)以及吉布斯自由能變?chǔ)(見表2)。

表2 楊梅素與DNA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters for the association of myricetin with ct-DNA

由表2可見，ΔG為負(fù)值，說明該體系的結(jié)合為自發(fā)過程。焓變大于熵變，說明楊梅素與DNA之間的結(jié)合為焓驅(qū)動(dòng)過程;ΔH，ΔS均為負(fù)值，表明兩者的結(jié)合主要基于氫鍵和范德華力。DNA堿基對(duì)之間依靠氫鍵連接，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明楊梅素可能通過氫鍵作用于大溝或小溝的堿基對(duì)邊緣，具有一定特異性。

2.2.4 楊梅素與熱變性DNA的相互作用 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)因具有氫鍵作用力和堿基堆積作用而非常穩(wěn)定。隨著溫度的升高，一些化學(xué)鍵被破壞，雙螺旋解離為單鏈結(jié)構(gòu)，不利于小分子的嵌插結(jié)合。如果楊梅素通過嵌插作用與DNA結(jié)合，當(dāng)發(fā)生熱變性效應(yīng)解旋為單鏈DNA(ssDNA)后，堿基對(duì)被破壞，DNA解螺旋，兩者不能再發(fā)生相互作用，ssDNA對(duì)楊梅素的猝滅強(qiáng)度會(huì)顯著降低。

通過熒光實(shí)驗(yàn)考察未變性的雙鏈DNA(dsDNA)與變性的單鏈DNA同楊梅素的相互作用，并以F0/F對(duì)濃度作圖，對(duì)比正常雙鏈DNA與變性單鏈DNA在結(jié)構(gòu)方面的差異(圖5)。dsDNA對(duì)楊梅素的猝滅常數(shù)Ksv為1.87 ×103mol－1(r=0.995 5)，ssDNA 的猝滅常數(shù) Ksv為1.42 ×103mol－1(r=0.994 6)。說明dsDNA和ssDNA均可對(duì)楊梅素的熒光產(chǎn)生猝滅作用，且變性后得到的ssDNA猝滅楊梅素?zé)晒獾哪芰β杂薪档?。這說明楊梅素與DNA的主要作用模式不是嵌插作用，而是通過溝槽結(jié)合的方式發(fā)生相互作用。

圖5 dsDNA和ssDNA與楊梅素相互作用的Stern－Volmer曲線圖Fig.5 Stern－Volmer plots for MYR quenching by dsDNA and ssDNA

2.3 圓二色光譜

圓二色光譜用于研究楊梅素與DNA的結(jié)合對(duì)DNA構(gòu)象的影響。圓二色光譜的信號(hào)強(qiáng)度改變與DNA結(jié)構(gòu)的變化有對(duì)應(yīng)關(guān)系。DNA的CD譜由245 nm處的負(fù)峰和276 nm處的正峰組成，前者對(duì)應(yīng)DNA的右手螺旋B構(gòu)象，后者對(duì)應(yīng)DNA的堿基堆積，兩者均對(duì)DNA與小分子的相互作用模式非常敏感。小分子與DNA的溝區(qū)結(jié)合和靜電結(jié)合對(duì)堿基堆積和螺旋的色帶影響很小或幾乎沒有影響，而嵌插結(jié)合會(huì)改變色帶的穩(wěn)定和DNA的右手螺旋B構(gòu)象［22－23］。

無配位體或藥物存在以及加入2.3 μmol·L－1楊梅素時(shí)DNA的圓二色光譜見圖6。圖6可見，與游離DNA的圓二色光譜相比，楊梅素的加入使得譜圖的正峰和負(fù)峰強(qiáng)度略有減弱，同時(shí)正峰位伴有輕微藍(lán)移(約1.0 nm)，說明楊梅素能輕微減弱DNA的堿基堆積作用和雙螺旋結(jié)構(gòu)，但未能形成嵌插結(jié)合，DNA仍保留B型結(jié)構(gòu)。

圖6 DNA(a)與DNA－楊梅素復(fù)合物(b)的圓二色譜圖Fig.6 CD spectra of DNA(a)and DNA－MYR complex(b)

2.4 分子模擬研究

分子模擬技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物大分子物質(zhì)與配體的相互作用研究，其結(jié)果具有直觀性、準(zhǔn)確性，并能與光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果互相證明，互相補(bǔ)充［24］。通過Auto Grid 4和Auto Dock 4的程序計(jì)算，從運(yùn)行得到的10個(gè)可能存在的結(jié)構(gòu)中篩選出6個(gè)RMSD值(Root mean square deviation，均方根偏差)為0的最低能量構(gòu)象。再通過篩選找到這6種構(gòu)象中結(jié)合能(Binding energy)最低的，即為分子模擬楊梅素與DNA相互作用的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象(表3)。圖7A和B顯示，楊梅素與DNA作用的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象位點(diǎn)位于雙螺旋內(nèi)部的小溝中，屬于溝槽結(jié)合，此時(shí)復(fù)合物的結(jié)合能為－29.2 kJ/mol，周圍富含A－T堿基對(duì)，包括DA5－DT20，DA6－DT19，DT7－DA18和DA8－DT17。此時(shí)分子間能(Intermolecular energy)為 －37.95 kJ/mol，分子內(nèi)能(Internal energy)為 －12.51 kJ/mol，扭轉(zhuǎn)能量(Torsional energy)為8.74 kJ/mol，非鍵合擴(kuò)散能(Unbound extended energy)為 －12.51 kJ/mol，范德華力、氫鍵作用力和溶解作用力共同產(chǎn)生的能量EVHD為－37.61 kJ/mol(vdw_Hbond_desolv_energy)，靜電作用能量(Electrostatic energy)為－0.33 kJ/mol，表明楊梅素與DNA是通過范德華力和氫鍵發(fā)生作用。圖7C顯示，楊梅素A環(huán)中7位OH和B環(huán)中3’位OH中的O被氫鍵中的O所形成的氧親和性口袋所浸沒，說明氫鍵是分子間相互作用的主要類型，同時(shí)指出了配體中相應(yīng)位點(diǎn)的O是分子結(jié)構(gòu)中的活性位點(diǎn)，這對(duì)于研究藥物結(jié)構(gòu)與藥理活性之間的關(guān)系具有重要啟示。圖7D進(jìn)一步明確了配體與堿基對(duì)的作用力類型和結(jié)合位點(diǎn)，其中結(jié)合位點(diǎn)與圖7C的預(yù)測(cè)一致:楊梅素A環(huán)中的7-O與A鏈DA18、B環(huán)中的3’-O與B鏈DA6通過氫鍵結(jié)合，結(jié)合距離分別為2.061和1.918，說明楊梅素與DNA中的腺嘌呤A能夠通過氫鍵的方式發(fā)生相互作用。這與熱力學(xué)研究結(jié)果一致，體現(xiàn)了分子模擬研究對(duì)光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的印證和支持。

表3 Auto Dock 4程序模擬出的楊梅素與DNA結(jié)合可能存在的不同構(gòu)象Table 3 Docking summary of DNA with MYR by the Auto Dock 4 program generating different ligand conformers

圖7 DNA片段與楊梅素配體的分子模擬結(jié)果Fig.7 Molecular docked model of MYR with DNA dodecamer duplex of sequence d(CGCGAATTCGCG)2(PDB ID:1BNA)

3 結(jié)論

本文采用紫外吸收光譜、熒光光譜、圓二色譜法和分子模擬法共同探索了黃酮類藥物楊梅素與ct-DNA的相互作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊梅素與ct-DNA通過溝槽結(jié)合方式發(fā)生相互作用，結(jié)合位點(diǎn)位于雙螺旋邊緣的小溝，周圍富含堿基A和T，這對(duì)于抗腫瘤藥物是一種有意義的重要結(jié)合方式。具體結(jié)論如下:①熒光光譜實(shí)驗(yàn)表明，ct-DNA能夠猝滅楊梅素的內(nèi)源熒光，猝滅方式為靜態(tài)猝滅，猝滅常數(shù)與溝槽結(jié)合劑一致，明顯小于嵌插結(jié)合劑，相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為1.86×103mol－1和1。②熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算結(jié)果顯示，楊梅素和DNA主要通過氫鍵和范德華力相互作用。③變性后的ssDNA雖然雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，堿基對(duì)排列次序改變，但對(duì)楊梅素的熒光猝滅效果未發(fā)生明顯變化，說明兩者并非通過嵌插結(jié)合。④圓二色光譜的研究表明，楊梅素未能誘導(dǎo)ct-DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。⑤分子模擬的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊梅素與DNA結(jié)合的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象位于雙螺旋內(nèi)的小溝，藥物分子中的7-O和3’-O可與DA18和DA6這兩對(duì)堿基中的H形成氫鍵，這與熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。上述研究結(jié)論對(duì)于設(shè)計(jì)、合成、篩選抗癌藥物有重要意義，對(duì)于實(shí)現(xiàn)按照預(yù)先設(shè)計(jì)的結(jié)合位點(diǎn)，合成高度專一性的新藥，以及對(duì)疾病的治療均有指導(dǎo)意義。

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