韓笑，王欣玲，吳迪，張勁松，閻啟昌

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110005；2.遼寧省晶狀體學(xué)實驗室，沈陽 110005）

SUMO蛋白在體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞內(nèi)的表達及對氧化應(yīng)激的調(diào)控作用

韓笑1，2，王欣玲1，2，吳迪1，2，張勁松1，2，閻啟昌1，2

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110005；2.遼寧省晶狀體學(xué)實驗室，沈陽 110005）

目的觀察小泛素相關(guān)修飾物（SUMO）在體外正常培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04）內(nèi)的表達以及由高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下SUMO的變化，探討其對氧化應(yīng)激的調(diào)控作用。方法通過免疫細胞化學(xué)染色法，檢測SUMO1，2/3，4蛋白在正常培養(yǎng)的SRA01/04內(nèi)的表達及分布；通過RT-PCR法，觀察不同濃度和時間高糖處理時SUMO1～4 mRNA的表達變化。按濃度實驗分組：葡萄糖濃度分別為5.5、12.5、25、50 mmol/L作用24 h。按時間實驗分組：葡萄糖濃度50 mmol/L作用0、6、12、24 h。將GFP-SUMO2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞后通過CCK8檢測法和AV/PI雙染流式細胞儀檢測高糖（50 mmol/L）處理后，轉(zhuǎn)染與非轉(zhuǎn)染組的細胞存活率和細胞凋亡率。結(jié)果免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果，SUMO 1～4蛋白在SRA01/04細胞內(nèi)主要分布于細胞核，SUMO 2/3同時少量分布于胞質(zhì)；RT-PCR結(jié)果可見，與低糖組比較，高糖組隨著糖濃度增加SUMO1～SUMO4 mRNA表達增加（P＜0.05）；與50 mmol/L高糖處理0 h比較，隨著處理時間增加SUMO1～SUMO4 mRNA表達增加（P＜0.05）。與非轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染GFPSUMO2的SRA01/04經(jīng)高糖處理后存活率增加，凋亡率降低（P＜0.05）。結(jié)論SUMO蛋白在SRA01/04內(nèi)陽性表達，一定程度高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響SUMO mRNA表達。

小泛素相關(guān)修飾物；人晶狀體上皮細胞；白內(nèi)障；高糖；氧化應(yīng)激

白內(nèi)障是一種常見且嚴重致盲疾病之一，一般認為氧化損傷是其重要致病途徑，晶狀體上皮細胞過度凋亡是其重要病理機制［1］。高濃度血糖易導(dǎo)致1型糖尿病患者并發(fā)糖尿病性白內(nèi)障，并加速2型糖尿病患者年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成［2，3］，大量實驗已證高糖誘導(dǎo)氧化損傷引起晶狀體上皮細胞過度凋亡［4，5］。一定程度范圍內(nèi)的氧化應(yīng)激損傷細胞的同時，會啟動各種機制引起基因表達和蛋白翻譯后修飾等細胞程序進行細胞保護［6］。小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifiers，SUMO）介導(dǎo)的SUMO化作為蛋白翻譯后修飾也參與氧化過程，保護底物蛋白穩(wěn)定性并進行細胞保護［7～9］。哺乳動物的SUMO家族蛋白具有4個分型，以3種形式存在：SUMO1、SUMO2/3和SUMO4［10，11］。研究表明在體外培養(yǎng)的不同組織或細胞中SUMO蛋白受到氧化應(yīng)激因素刺激時表達量會隨之改變，如低氧［12］、熱休克［13］、高糖［14］以及H2O2［15］等。為探索SUMO蛋白在人晶狀體上皮細胞內(nèi)的表達情況以及對氧化應(yīng)激的調(diào)控作用，本實驗以體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞系（SRA01/04）為基礎(chǔ)，研究SUMO蛋白在高糖誘導(dǎo)的氧化損傷過程中對細胞的生物學(xué)影響和可能機制，為進一步深入探討SUMO化修飾在白內(nèi)障疾病發(fā)病機制中的作用奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞系和質(zhì)粒

人晶狀體上皮細胞系SRA01/04為中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院，眼科晶狀體學(xué)實驗室提供。質(zhì)粒GFP-SUMO2為德克薩斯A&M大學(xué)系統(tǒng)健康科學(xué)中心微生物與免疫學(xué)Van G.Wilson教授贈予。

1.2 主要試劑

兔抗SUMO1，4單克隆抗體和兔抗SUMO2/3多克隆抗體購自Abcam公司。即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒購自福州邁新生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV First stand Kit）、PCR試劑盒（Taq DNA Polymerase Recombinant）、轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）和GFP空熒光質(zhì)粒購自Invitrogen公司。CCK8試劑和Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

凍存SRA01/04細胞復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，第3代隨機分組于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。用含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基（葡萄糖5.5 mmol/L），在5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃下培養(yǎng)。

1.4 免疫細胞化學(xué)

細胞懸液置于24孔板內(nèi)的爬片上過夜貼片培養(yǎng)。次日細胞融合約70%～80%后去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定20 mim。依據(jù)即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒說明操作。兔抗SUMO 1、2/3、4抗體按說明稀釋，4℃孵育過夜。蘇木素核染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封閉于載玻片上，正像顯微鏡觀察和照相。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR和實驗分組

細胞懸液隨機等量分組于培養(yǎng)皿中過夜貼壁。次日細胞融合約80%，用不同濃度（5.5，12.5，25，50 mmol/L）高糖處理24 h，以及用50 mmol/L高糖處理不同時間：0，6，12，24 h。按說明用Trizol試劑分別提取RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)DNA大量擴增，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測產(chǎn)物條帶，圖像分析系統(tǒng)計算目的基因條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參獲得相對比值。重復(fù)3次以上獨立實驗。目的基因引物序列見表1。

表1 各基因引物序列Tab.1 The sequences of primers

1.6 細胞轉(zhuǎn)染和實驗分組

細胞懸液隨機等量以1×106/mL接種于6孔板中，用僅有血清無雙抗低糖DMEM培養(yǎng)基過夜貼壁。換無血清無雙抗培養(yǎng)基，依據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的操作步驟，將GFP-SUMO2質(zhì)粒和GFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SRA01/04細胞內(nèi)6 h后，換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)40 h。選取高效轉(zhuǎn)染的細胞和未轉(zhuǎn)染細胞，實驗分組為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組（對照組）、GFP空質(zhì)粒組（empty-GFP組）、GFP-SUMO2組，分別用于CCK8檢測和Annexin V-FITC/PI檢測。

1.7 CCK8檢測SRA01/04細胞存活

上述各組細胞隨機等量以1×104/mL接種于96孔板用100 μL培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，每組8復(fù)孔，用50 mmol/L高糖培養(yǎng)基處理各組細胞24 h。另設(shè)細胞空白對照組（僅有培養(yǎng)基無細胞無處理8復(fù)孔）。每孔換正常培養(yǎng)基加入CCK8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h。全自動酶標分析儀檢測波長為450 nm的每孔光密度（optical density，OD）值。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組為對照組，GFP空質(zhì)粒組和GFP-SUMO2組為實驗組。各組細胞存活率=（實驗組OD值-細胞空白對照組OD值）/（對照組OD值-細胞空白對照組OD值）× 100%。重復(fù)3次以上獨立實驗。

1.8 Annexin V-FITC/PI檢測SRA01/04細胞凋亡

各組細胞隨機等量1×106/mL接種于6孔板貼壁培養(yǎng)，每組3復(fù)孔，用50 mmol/L高糖培養(yǎng)基處理各組細胞24 h，按Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明操作處理，另設(shè)Annexin V-FITC（-）PI（-），Annexin V FITC（+）PI（-）和Annexin V-FITC（-）PI（+）3組作為染料對照組，利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組為對照組，GFP空質(zhì)粒組和GFPSUMO2組為實驗組。各組細胞凋亡率相對比值=實驗組凋亡率/對照組凋亡率×100%。重復(fù)3次以上獨立實驗。

1.9 統(tǒng)計學(xué)

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SUMO蛋白在正常體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞內(nèi)表達

使用細胞免疫化學(xué)方法觀察SUMO蛋白在體外正常培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞內(nèi)的表達情況。SUMO1蛋白主要表達于晶狀體上皮細胞核內(nèi)；SUMO 2/3蛋白主要表達于晶狀體上皮細胞核內(nèi)，部分表達于胞質(zhì)內(nèi)；SUMO4蛋白主要表達于晶狀體上皮細胞核及核周胞質(zhì)內(nèi)，見圖1。

圖1 SUMO蛋白在人晶狀體上皮細胞內(nèi)的表達Fig.1 SUMO protein expression in human lens epithelial c ells

2.2 高糖處理SRA01/04細胞影響SUMO表達

隨著一定范圍內(nèi)葡萄糖濃度的增加，SUMO1、SUMO2/3、SUMO4 mRNA表達增加，與5.5 mmol/L低糖組比較，12.5，25和50 mmol/L高糖組SUMO1～ 4 mRNA表達水平均增加（P＜0.05）。用葡萄糖濃度為50 mmol/L培養(yǎng)基分別處理0，6，12，24 h，結(jié)果可見，隨著高糖處理時間的增加，SUMO1、SUMO2/3、SUMO4mRNA表達增加（P＜0.05）。見圖2、圖3。

圖2 不同濃度高糖處理影響SUMO表達Fig.2 SUMO mRNA expression induced by different concentrations of high glucose

圖3 不同時間高糖（50 mmol/L）處理SUMOmRNA表達比較Fig.3 SUMO mRNA expression induced by high glucose treatment（50 mmol/L）at different time points

2.3 轉(zhuǎn)染SUMO2后改變高糖對SRA01/04細胞存活的影響

選取高效轉(zhuǎn)染的SRA01/04細胞（圖4）與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SRA01/04分別以1×104/mL鋪96孔板，并用50 mmol/L高糖處理細胞24 h后，觀察SRA01/04細胞存活情況。結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染GFP-SUMO2的SRA01/ 04細胞抵抗高糖氧化損傷的能力增強，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組比較細胞存活增加（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒組的SRA01/04細胞抵抗高糖氧化損傷的能力未見明顯改變，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組比較細胞存活未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖5。

圖4 GFP-SUMO2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SRA01/04細胞Fig.4 Transfection of GFP-SUMO2 into SRA01/04 cells

2.4 轉(zhuǎn)染SUMO2后改變高糖對SRA01/04細胞凋亡的影響

選取高效轉(zhuǎn)染的SRA01/04細胞（圖4）與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SRA01/04分別以1×106/mL鋪6孔板，并用50 mmol/L高糖處理細胞24 h后，觀察SRA01/04細胞凋亡情況。結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染GFP-SUMO2的SRA01/ 04細胞抵抗高糖氧化損傷的能力增強，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組比較細胞凋亡減少（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒組的SRA01/04細胞抵抗高糖氧化損傷的能力未見明顯改變，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組比較細胞凋亡未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見圖6。

圖5 各組細胞存活率Fig.5 Survival rate of cells in different groups

3 討論

SUMO蛋白介導(dǎo)SUMO化作為一種蛋白翻譯后修飾正成為近年各疾病發(fā)病機制的研究熱點，大量研究報道SUMO化修飾保護底物蛋白穩(wěn)定并影響其生物學(xué)功能，參與調(diào)控氧化損傷等生理和病理過程［16，17］。SUMO蛋白參與蛋白翻譯后修飾具有重要的作用，包括轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、DNA修復(fù)、影響蛋白分布和細胞外應(yīng)激應(yīng)答等［11，18～21］。

圖6 各組細胞凋亡率Fig.6 Apoptotic rate of cells in different groups

本研究首先通過免疫細胞化學(xué)染色方法明確SUMO家族蛋白在體外正常培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞表達及定位情況，SUMO1和SUMO4主要表達于細胞核，SUMO2/3則在細胞核及部分胞質(zhì)均有表達。利用高糖構(gòu)建氧化損傷所致的白內(nèi)障模型，觀察到在一定范圍內(nèi)增加高糖處理濃度或延長高糖處理時間，SUMO1、SUMO2/3、SUMO4在mRNA水平表達均增加，推測SUMO參與高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞氧化損傷的生物學(xué)過程。Huang等［14］研究表明SUMO1～3在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞受到高糖處理的影響在mRNA及蛋白水平上均呈現(xiàn)表達增加。Shao等［22］報道低氧處理小鼠后，心臟和腦組織內(nèi)SUMO1蛋白表達增加。為進一步探討氧化應(yīng)激條件下SUMO改變發(fā)生的細胞生物學(xué)效應(yīng)，將GFP-SUMO2質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人晶狀體上皮細胞內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達SUMO2后，轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)高糖處理后表現(xiàn)出抑制高糖對細胞的氧化損傷，增加細胞的存活率并降低了細胞凋亡率。推測SUMO過表達，促進了其穩(wěn)定多種底物蛋白，影響和調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子等功能作用，進而產(chǎn)生對人晶狀體上皮細胞的保護。Park等［23］研究發(fā)現(xiàn)過表達SUMO2/3調(diào)控DBC1的SUMO化，進而影響P53介導(dǎo)的DNA損傷和細胞凋亡。近年大量研究表明SUMO蛋白參與SUMO化及去SUMO化的修飾酶對于腫瘤、神經(jīng)退行性病變、衰老等疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響和調(diào)控［24～28］。深入探索在人晶狀體上皮細胞內(nèi)SUMO蛋白對底物蛋白的修飾，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子以及SUMO化和去SUMO化修飾酶功能等與白內(nèi)障發(fā)病機制的關(guān)系，將成為我們實驗組未來的目標。

綜上所述，SUMO表達于體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞內(nèi)，并受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響，在一定濃度和時間范圍內(nèi)的高糖環(huán)境中，SUMO在mRNA水平隨高糖濃度或時間增加而表達增多。體外細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染SUMO2質(zhì)粒后，SUMO2過表達有助于保護受到氧化應(yīng)激的晶狀體上皮細胞，促進細胞存活并減少細胞凋亡，從而部分抑制高糖對人晶狀體上皮細胞的損傷。這可能是SUMO蛋白參與眾多蛋白的翻譯后修飾，影響底物蛋白穩(wěn)定性，調(diào)控底物蛋白發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，因此SUMO蛋白及SUMO化修飾可能成為探索白內(nèi)障發(fā)病機制及防治的新方向。

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（編輯武玉欣）

SUMOExpression and Regulation in Oxidative Stressin Cultured Human Lens EpithelialCells

HANXiao1，2，WANGXin-ling1，2，WUDi1，2，ZHANGJin-song1，2，YANQi-chang1，2
（1.DepartmentofOphthalmology，The Forth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110005，China；2.Laboratory ofLens Research ofLiaoning Province，Shenyang 110005，China）

ObjectiveTo observe the expression of small ubiquitin-related modifiers（SUMO）protein in normal cultured human lens epithelial cells（SRA01/04）and discuss regulation effects of SUMO protein on oxidative stress induced by high glucose.MethodsThe expression and localization of SUMO 1，2/3，4 was detected in normal cultured SRA01/04 cells through immunocytochemistry.The mRNA expression levels of SUMO 1 -4 were examined by RT-PCR after the SRA01/04 cells treated with high glucose media at different concentrations and time points.Samples were grouped by medium concentrations（glucoses 5.5 mmol/L，12.5 mmol/L，25 mmol/L，50 mmol/L respectively for 24 h）and by treatment time（0 h，6 h，12 h and 24 h respectively）.Afterhighly efficienttransfection ofGFP-SUMO2 into SRA01/04 cells，the survivaland apoptotic rates oftransfected and un-transfected cellstreated with high glucose was detected by CCK8 method and AV/PIdouble staining flow cytometry.ResultsThe immunocytochemistry results showed that SUMO1，2/3，4 proteins were mainly located in the nucleus of SRA01/04 cells and part of SUMO2/3 was in the cytoplasm.RT-PCR results showed thatcompared with the low-glucose group，the mRNAexpression of SUMO1-4 was increased along the increasing glucose concentration in the high-glucose group（P＜0.05）.Compared with 0 h，the mRNA expression of SUMO1-4 wasenhanced at6 h，12 h and 24 h（P＜0.05）in the high-glucose group treated at 50 mmol/L concentration.Compared with the un-transfected cells，the survival rate was increased and the apoptotic rate was decreased in GFP-SUMO2 transfected cells in oxidative stress induced by high glucose（P＜0.05）.ConclusionSUMO protein was positively expressed in SRA01/04 cells and the expression of SUMO mRNA was affected by oxidative stress induced by high glucose.

small ubiquitin-related modifiers；human lens epithelial cells；cataract；high glucose；oxidative stress

R776.1

A

0258-4646（2015）03-0193-06

國家自然科學(xué)基金（81170836）；遼寧省自然科學(xué)基金（201202260；2013021016）

韓笑（1986-），女，博士研究生.

閻啟昌，E-mail：cmu4h_yqc@163.com

2014-11-02

網(wǎng)絡(luò)出版時間：