王 偉，張 強(qiáng)，王海梅，郭 普，鐘政榮(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，蚌埠 233004)

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)是一類(lèi)在細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，全球感染沙眼衣原體的人數(shù)多以億計(jì)［1，2］，僅治療所需的費(fèi)用就高達(dá)數(shù)十億美元［2］。在沙眼衣原體的 18 個(gè)血清型中［3］，沙眼生物型A、B、Ba、C血清型可感染眼結(jié)膜，居于致盲病因的首位，而D-K血清型可以引起生殖道感染或泌尿系統(tǒng)感染，是目前導(dǎo)致男性不育或女性不孕的重要原因之一［4，5］。雖然抗生素對(duì)沙眼衣原體的感染有較好的療效，但因沙眼衣原體的感染常為隱性感染，致使絕大多數(shù)患者在感染早期不能及時(shí)就診［6］。臨床治療中大規(guī)模使用抗生素還可能造成耐藥株的出現(xiàn)。因此，使用疫苗進(jìn)行預(yù)防是最為合理有效的防治措施［7］。2000年，Pizza革命性地創(chuàng)造了一種新的研究策略，首先應(yīng)用于B型腦膜炎奈瑟菌的疫苗研究中，由于與傳統(tǒng)疫苗的研究策略剛好相反，因此被稱(chēng)為逆向疫苗學(xué)。逆向疫苗學(xué)與傳統(tǒng)疫苗學(xué)研究的不同之處在于需要計(jì)算機(jī)的輔助，不需要體外培養(yǎng)病原菌。而是通過(guò)對(duì)某一病原體的基因組測(cè)序分析，篩選出抗原決定簇，通過(guò)高通量技術(shù)，在短期內(nèi)完成大量候選抗原的克隆、表達(dá)和純化，鑒定出具有一定免疫原性特征的蛋白質(zhì)，為一些不能用傳統(tǒng)疫苗研究方法獲得有效疫苗的疑難疫病的防控開(kāi)辟了一條新的途徑。本研究應(yīng)用逆向疫苗學(xué)理論，在沙眼衣原體全基因組測(cè)序完成的基礎(chǔ)上，整合生物信息學(xué)分析、比較基因組數(shù)據(jù)、基因表達(dá)豐度分析和免疫蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)初步篩選針對(duì)沙眼衣原體疫苗的候選抗原，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 生物信息學(xué)分析、預(yù)測(cè)編碼表面暴露蛋白的基因

基因組數(shù)據(jù)為GenBank中全基因組測(cè)序菌株L2b/UCH-1/proctitis株，應(yīng)用 P-CLASSIFIER［8］預(yù)測(cè)沙眼衣原體蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。應(yīng)用SignalP 3．0［9］預(yù)測(cè)沙眼衣原體蛋白質(zhì)中的信號(hào)肽。沙眼衣原體蛋白質(zhì)中的α-穿膜螺旋結(jié)構(gòu)用TMHMM預(yù)測(cè)［10］。BOMP［11］用來(lái)預(yù)測(cè)沙眼衣原體中的β-桶型外膜蛋白。脂蛋白用 SpLiP 預(yù)測(cè)［12］。BLASTP［13］程序用來(lái)比對(duì)沙眼衣原體不同型別之間以及沙眼衣原體和人之間的同源蛋白質(zhì)。

1．2 實(shí)時(shí)定量PCR

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的衣原體(Hep-2細(xì)胞系和沙眼衣原體菌株由蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心保存)，使用Trizol一步法抽提總RNA，并將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè) CTLon_0133、CTLon_0242、CTLon_0288、CTLon_0395等蛋白編碼基因的表達(dá)量，內(nèi)參使用16srDNA序列，引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95℃ 30 s，95℃ 5 s，54℃ 30 s共35個(gè)循環(huán)。

表1 擴(kuò)增基因引物序列Table 1 The primer sequences and PCR conditions

1．3 蛋白表達(dá)純化

cDNA核酸片斷克隆進(jìn)pET28b(+)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α細(xì)胞，IPTG濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)可溶性鑒定后，冰上超聲破碎細(xì)胞后，在非變性條件下，終濃度為0．05%Triton X-100，抽提蛋白。NTA樹(shù)脂層析，洗滌并濃縮。加入等體積2×SDS上樣緩沖液進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，80 V，350 mA，半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，2 h后，加入相應(yīng)的抗體稀釋液，4℃過(guò)夜。TBS/0．5%Tween20洗膜3-4次后，每次10 min，再加入l∶2 000稀釋的抗HRP抗體，37℃孵育1 h，TBS/0．5%Tween20充分洗膜3-4次后，每次致少10 min，用ECL顯色系統(tǒng)檢測(cè)相應(yīng)信號(hào)并分析。

1．4 免疫動(dòng)物

每組蛋白免疫4只BALB/c小鼠，初次免疫后第10天和第20天分別加強(qiáng)免疫兩次，采用皮下多點(diǎn)注射，注射劑量為10 μg/只，第一次注射用弗氏完全佐劑1∶1混合，第二、三次注射用弗氏不完全佐劑1∶1混合，到第35天全部小鼠眼球取血，處死。

1．5 ELISA法檢測(cè)抗體特異性

按標(biāo)準(zhǔn)ELISA法，利用純化的重組蛋白包被96孔板過(guò)夜，用PBS洗滌后BSA封閉，每孔加200倍稀釋的100 μl血清，室溫結(jié)合30 min;PBS洗板3次，加堿性磷酸酶AP標(biāo)記IgG抗體，室溫結(jié)合1 h;PBS洗板 3次，加底物 pNPP，室溫反應(yīng) 15 min，NaOH中止反應(yīng)，405 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)中各檢測(cè)樣品重復(fù)3孔，以樣品孔OD吸光度值≥陰性對(duì)照平均值+3×陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)差者為陽(yáng)性。

1．6 凝集試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)

用無(wú)菌生理鹽水在無(wú)菌96孔板上稀釋待測(cè)血清為1∶25-1∶3 200，每排各孔中加入稀釋血清100 μl，最后一孔用生理鹽水作陰性對(duì)照。將培養(yǎng)好的生長(zhǎng)良好的原體混懸液加入各排孔內(nèi)，每孔100 μl，混勻后置37℃孵育2 h。用吸管取各孔中反應(yīng)懸液滴于清潔載玻片上，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察結(jié)果。若凝集成團(tuán)，呈蜘蛛狀或原體溶解成顆粒狀或蝌蚪狀則為陽(yáng)性。記錄下出現(xiàn)陽(yáng)性凝集的血清最高稀釋度，血清抗體效價(jià)判斷標(biāo)準(zhǔn):能與抗原發(fā)生凝集反應(yīng)(++)的血清最高稀釋度為抗體最終效價(jià)。

2 結(jié)果

2．1 生物信息學(xué)分析編碼表面暴露蛋白基因的預(yù)測(cè)結(jié)果

沙眼衣原體基因組中有890個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORFs)，應(yīng)用P-CLASSIFIER預(yù)測(cè)216個(gè)蛋白質(zhì)為表面暴露蛋白;同時(shí)應(yīng)用相應(yīng)的生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，在890個(gè)ORFs中有224個(gè)蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽，261個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)具有不超過(guò)4個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)的α-螺旋結(jié)構(gòu)，89個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)具有β-桶型結(jié)構(gòu)，63個(gè)蛋白質(zhì)為脂蛋白。P-CLASSIFIER預(yù)測(cè)表面暴露蛋白和具有以上4個(gè)特征性結(jié)構(gòu)之一的蛋白質(zhì)的交集數(shù)目是126個(gè)。應(yīng)用BLASTP計(jì)算出衣原體不同型別株蛋白質(zhì)以及和人蛋白質(zhì)之間的相似性(cutoff值，不同血清衣原體相似性＞70%且E值≤e×10-10;衣原體株和人蛋白質(zhì)E值≤e×10-10)。結(jié)果顯示，在兩個(gè)血清型衣原體間有672個(gè)同源蛋白質(zhì)，與人蛋白質(zhì)之間相似的蛋白質(zhì)數(shù)目為68個(gè)。在126個(gè)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集中保留衣原體間的同源蛋白質(zhì)，并且去除掉和人之間相似的蛋白質(zhì)后，最終得到73個(gè)蛋白質(zhì)。這73個(gè)蛋白編碼基因?yàn)樯镄畔W(xué)分析的最終結(jié)果。通過(guò)比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果包括已經(jīng)證實(shí)的外膜蛋白如:MOMP等，這也證實(shí)我們預(yù)測(cè)方法的可行性。

2．2 實(shí)時(shí)定量PCR

從73個(gè)基因中挑取30個(gè)未曾鑒定過(guò)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)，對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。與16srDNA相比，這30個(gè)基因表達(dá)量為其0．2-5．4倍不等。我們選取了其中表達(dá)最高的4個(gè)基因，分別為 CTLon_0133，CTLon_0242，CTLon_0288，CTLon_0395，分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

2．3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

cDNA核酸片段克隆進(jìn)pET28b(+)質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5α細(xì)胞，表達(dá)的蛋白經(jīng)抽提、洗滌并濃縮后，CTLon_0133，CTLon_0242，CTLon_0288，CTLon_0395四種高表達(dá)基因的Western blot檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖2)。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)候選基因表達(dá)結(jié)果Figure 1 Expression of candidate genes by real-time quantitative PCR

圖2 四種高表達(dá)基因蛋白表達(dá)純化后在15種血清型中Western blot檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Western blot analysis of the expression of CTLon_0133，CTLon_0242，CTLon_0288，CTLon_0395 proteins in 15 serotypes

2．4 免疫動(dòng)物血清效價(jià)鑒定結(jié)果

對(duì) CTLon_0133，CTLon_0242，CTLon_0288，CTLon_0395構(gòu)建質(zhì)粒在DH5α工程菌中表達(dá)并純化，免疫BALB/c小鼠。血清特異性檢測(cè)及其效價(jià)分析結(jié)果見(jiàn)表2，3。凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C_0133、C_0242、C_0288和C_0395的抗體效價(jià)分別為1∶800，1∶400，1∶1 600 和1∶400，C_0288 蛋白產(chǎn)生的抗體效價(jià)較高。

表2 CTLon_0133，CTLon_0242，CTLon_0288，CTLon_0395抗體特異性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Assessment of antibody specificity by ELISA for CTLon_0133，CTLon_0242

表3 CTLon_0133，CTLon_0242，CTLon_0288，CTLon_0395 抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Table 3 Assessment of antibody titers by ELISA for CTLon_0133，CTLon_0242

3 討論

現(xiàn)在使用的衣原體疫苗為全菌體或者外膜蛋白疫苗［14-17］。由于這些疫苗存在以下問(wèn)題:一是不同型別之間缺乏交叉保護(hù)，保護(hù)范圍較窄;二是保護(hù)時(shí)間短，需要多次免疫才能維持保護(hù)作用，尤其是不能引起機(jī)體長(zhǎng)期的免疫保護(hù)以及對(duì)不同血清型衣原體缺乏交叉保護(hù)作用，因此衣原體的亞單位疫苗成為研究的重點(diǎn)，一些疫苗候選分子如MOMP等相繼被研究鑒定［18］，雖然在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有較好的免疫保護(hù)效果，但至今沒(méi)有合適的衣原體亞單位疫苗進(jìn)入臨床，因此需要新的研究思路和方法進(jìn)行衣原體疫苗研究。

隨著200多種微生物的基因組測(cè)序相繼完成，對(duì)微生物的研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代即功能基因組時(shí)代。許多致病菌全基因組信息的獲得以及生物信息學(xué)的發(fā)展使得疫苗學(xué)的研發(fā)進(jìn)入了一個(gè)新的時(shí)代?，F(xiàn)在可以應(yīng)用逆向疫苗學(xué)的方法，從一個(gè)微生物的基因序列開(kāi)始篩選出疫苗候選基因。逆向疫苗學(xué)首先應(yīng)用于B群腦膜炎奈瑟菌［19］，現(xiàn)在已經(jīng)在多種微生物中應(yīng)用，如肺炎鏈球菌、鉤端螺旋體，無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎衣原體等［20］。逆向疫苗學(xué)研究的策略和方法主要有生物信息學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等。生物信息學(xué)分析是逆向疫苗學(xué)研究的第一個(gè)重要策略。衣原體的蛋白質(zhì)具有5種亞細(xì)胞定位，分別為胞質(zhì)、內(nèi)膜、周質(zhì)、外膜以及細(xì)胞外分泌蛋白質(zhì)。表面暴露蛋白質(zhì)是指位于內(nèi)膜、周質(zhì)、外膜和細(xì)胞外的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈兏子谂c抗體識(shí)別，從而可能會(huì)引起保護(hù)性免疫反應(yīng)，因此表面暴露蛋白是合適的疫苗候選分子?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多生物信息學(xué)軟件根據(jù)蛋白質(zhì)的序列分析預(yù)測(cè)它們?cè)谖⑸镏械膩喖?xì)胞定位情況［8，21，22］。逆向疫苗學(xué)研究的第二個(gè)重要策略是應(yīng)用芯片技術(shù)分析進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。熒光信號(hào)值高于中位值以上的基因代表著其在基因組中的轉(zhuǎn)錄超過(guò)5-10個(gè)mRNA拷貝［23］。這些高表達(dá)的基因可以作為疫苗的候選基因。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)等方法也可以用于逆向疫苗學(xué)篩選合適的疫苗候選分子。聯(lián)合使用這些研究方法，可以最終篩選鑒定到編碼潛在的疫苗抗原的基因。

在本課題的研究中，我們首先應(yīng)用P-CLASSIFIER程序預(yù)測(cè)分析衣原體L2b/UCH-1株中所有蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，P-CLASSIFIER是一個(gè)基于蛋白質(zhì)氨基酸序列以及多重支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的程序［8］。此外，我們又應(yīng)用相應(yīng)的生物信息學(xué)程序預(yù)測(cè)衣原體蛋白質(zhì)中具有α-穿膜螺旋、β-桶形結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽以及脂蛋白等4種特征結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。根據(jù)PCLASSIFIER程序預(yù)測(cè)分析的結(jié)果，衣原體中同時(shí)為表面暴露蛋白質(zhì)而且具有上述4種特征結(jié)構(gòu)(α-穿膜螺旋、β-桶形結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽以及脂蛋白)之一的蛋白質(zhì)作為疫苗候選分子的初選。同時(shí)，去除掉那些具有4個(gè)以上α-穿膜螺旋的蛋白質(zhì)，這是因?yàn)榫哂?個(gè)以上α-穿膜螺旋的蛋白質(zhì)會(huì)完全包埋在細(xì)胞膜內(nèi)而不容易接觸到抗體，而且因?yàn)樗鼈冸y以在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)BLAST程序，我們保留在衣原體L2b/UCH-1株基因組中的保守基因并去除衣原體L2b/UCH-1株與人同源的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐略wL2b/UCH-1株中與人同源的蛋白質(zhì)有可能會(huì)引起自身免疫反應(yīng)。最終，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析，衣原體疫苗候選基因的范圍縮小到73個(gè)基因。

為了初步驗(yàn)證我們預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，我們挑選出表達(dá)量較高的四個(gè)基因，進(jìn)行體外表達(dá)純化，并免疫BALB/c小鼠。通過(guò)體外抗體滴度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，CTLon_0288表達(dá)的蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生了滴度較高的抗體。

本研究通過(guò)綜合生物信息學(xué)的方法，成功預(yù)測(cè)出沙眼衣原體疫苗候選基因。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR挑取其中表達(dá)量相對(duì)較高的基因進(jìn)行分析，并進(jìn)行了免疫動(dòng)物和抗體效價(jià)的測(cè)定，證實(shí)逆向疫苗學(xué)理論在沙眼衣原體疫苗的抗原篩選工作中是可行的，為下一步尋找有效的候選抗原打下了良好的基礎(chǔ)。

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