賈利寧，田普訓，馬曉桃，付榮國，桂保松，田李芳，陳 釗，段朝陽，韓 錦，盧家美(西安交通大學第二附屬醫(yī)院腎病科，西安 70004;西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎移植科;通訊作者，E-mail:jldoctor@6．com)

器官移植是20世紀具有里程碑標志的臨床技術，拯救了眾多的終末期器官功能衰竭患者生命，使其能正常生活。但移植排斥反應是影響器官移植預后的主要因素［1，2］。在臨床實踐中，同種異體腎移植術后，最常見的排斥反應類型是急性排斥反應(AR)，占40%。慢性排斥反應(CR)為遠期移植物失功能的主要原因，影響受者長期高質(zhì)量生存的重要因素。目前對CR的研究一直沒有實質(zhì)性突破［3］。因此，在移植排斥反應的早期能發(fā)現(xiàn)一些預警分子或?qū)σ浦才懦夥磻臋C制有深入的認識，可能對器官移植的發(fā)展起著非常重要的作用［4-6］。

移植排斥反應是由多種細胞、多種分子參與的復雜免疫應答過程。在器官移植排斥反應中，T細胞起關鍵作用。T細胞活化需要三條途徑:T細胞抗原受體復合物(TCR)細胞內(nèi)信號、共刺激分子的調(diào)控以及免疫抑制性分子調(diào)節(jié)的一個復雜過程。其中，CD28和ICOS等共刺激分子是T細胞活化分子，而CTLA-4、PD-1和BTLA等抑制性共刺激分子抑制T細胞活化?？梢姡?、負免疫調(diào)節(jié)的平衡保證了宿主對移植器官的免疫應答，從而防止移植排斥反應的發(fā)生。

TIPE2(tumor necrosis factor-induced protein 8-like-2)由美國賓夕法尼亞大學孫宏宏在腦脊髓膜炎EAE動物模型中首先發(fā)現(xiàn)，將TIPE2基因敲除后導致炎癥反應加劇，固有免疫反應和適應性免疫反應均上調(diào)，認為其在維持免疫平衡中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用［7］。目前TIPE2在移植排斥中的作用尚無報道。本研究通過檢測TIPE2在腎移植排斥反應患者中的表達及免疫抑制劑對 TIPE2表達的影響，探討TIPE2在移植排斥中的作用。

1 研究對象和方法

1．1 研究對象

根據(jù)臨床診斷標準，選取西安交通大學第一、第二附屬醫(yī)院住院和門診就診的腎移植術后患者96例，其中急性排斥32例，慢性排斥33例，腎移植后長期存活31例。另選取32例健康人作對照組。入選標準:急性排斥、慢性排斥診斷標準根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、輔助檢查結(jié)果、移植腎組織病理學Banff 05標準;長期存活組:存活時間5年以上、腎功能穩(wěn)定、無蛋白尿)。排除患有惡性腫瘤、乙型、丙型肝炎、糖尿病和重癥感染、自身免疫性疾病的患者。血樣、組織樣品采集均得到患者的知情同意和倫理委員會的批準。

1．2 主要試劑

DNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑盒，均購自Invitrogen公司;單克隆 TIPE2抗體，購自美國 Santa Cruz Biotechnology公司;TRITC標記的鼠抗山羊IgG抗體購自北京中山金橋公司;人的淋巴細胞分離液購自美國 Sigma公司;環(huán)孢素 CsA購自 Novartis Pharma，Nürnberg，Germany和雷帕霉素購自 Wyeth-Ayerst，Madison，N．J，USA。

1．3 人外周血來源PBMC

取新鮮的人肝素抗凝外周血5 ml，用 PBS以1∶1的比例稀釋后沿離心管壁緩慢加到淋巴細胞分離液上，4℃，18 000×g，離心20 min后取白膜層細胞，用PBS以1 500×g，離心10 min，洗滌1次。

1．4 Western blot檢測PBMC中TIPE2蛋白的表達

按照蛋白質(zhì)濃度取20 μg TIPE2總蛋白，100℃變性10 min，12%-10%SDS-PAGE。以80 V電泳30 min，隨后將總蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，加入兔抗人TIPE2抗體(1∶100)，37℃水浴濕盒中振蕩1 h。洗膜后加入HRP-羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)，然后取化學發(fā)光試劑A和B各500 μl混合，均勻加上發(fā)光試劑混合液約1 min后，壓X膠片約1 min，取膠片放入顯影液中約2 min，再用定影液定影，晾干保存。應用Gel-Pro軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值。

1．5 免疫組化染色觀察移植腎組織中TIPE2表達

穿刺活檢所得移植腎組織用10%中性甲醛(pH 7．2)固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，制作4 μm石蠟組織切片，經(jīng)脫蠟、復水后，3%H2O2的室溫孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，再在微波爐中與枸櫞酸鹽緩沖溶液孵育10 mim以修復抗原，PBS洗片5 min×3次，10%山羊血清封閉10 min，分別滴加山羊抗人TIPE2抗體(1∶400)4℃過夜。PBS洗片5 min×3次，滴加生物素標記的大鼠抗山羊二抗IgG，37℃孵育20 min，PBS洗片5 min×3次，再滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素液，37℃孵育20 min，洗片后DAB顯色，蘇木素復染細胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并攝片。為排除非特異性染色，以PBS代替一抗作為陰性對照。用光密度法對移植腎組織中TIPE2的表達量化分析。

1．6 免疫抑制劑對TIPE2表達的影響

取外傷后脾切除患者脾臟，脾臟剪碎后用玻片研磨，用200目尼龍網(wǎng)過濾至15 ml離心管中，制成單細胞懸液。4℃，1 600 r/min，離心5 min，棄上清后沉淀混勻。室溫加入2 ml紅細胞裂解液，注意觀察顏色，顏色呈現(xiàn)嫩粉色即可。加入PBS 10 ml終止反應，4℃，1 600 r/min，離心5 min，棄上清。加入 PBS 10 ml，4 ℃，1 600 r/min，離心5 min，棄上清。沉淀重懸于2 ml含10%FCS的RPMI 1640中，細胞計數(shù)后備用。在96孔板中分別加入1×105/ml的淋巴細胞，分別加入環(huán)孢素 CsA(cyclosporine A，CsA)和雷帕霉素(Sir)，CsA 的濃度 10，100，1 000 ng/ml;Sir的濃度 10，100，1 000 nmol/L。培養(yǎng) 72 h收集細胞，提取總RNA，用RT-PCR檢測各組PBMC中TIPE2基因的表達。TIPE2的引物F:5＇-GGAACATCCAAGGCAAGACTG-3＇，R:5＇-A GCACCT-CACTGCTTGTCTCATC-3＇，大小 185 bp。β-actin 作為內(nèi)參，應用Gel-Pro軟件分析目的片段與內(nèi)參的灰度比值。

1．7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2．1 一般資料

四組患者年齡、性別無統(tǒng)計學差異(P＞0．05，見表1)。患者移植的其他基本情況見表1。

表1 腎移植受者的基本特征Table 1 General characteristics of renal transplant recipients and healthy controls

2．2 PBMCs中TIPE2蛋白的表達

Western blot檢測各組PBMCs中TIPE2蛋白的表達，Gel-Pro軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值，研究結(jié)果表明:與對照組比較，急性排斥組PBMC中TIPE2表達下降(P＜0．05)，但慢性排斥組表達則明顯增高(P＜0．001)，長期存活組TIPE2的表達輕度升高，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05，見圖1)。

圖1 Western blot檢測各組PBMC中TIPE2蛋白的表達Figure 1 Western blot analysis for TIPE2 protein expression in PBMCs

2．3 移植腎組織中TIPE2表達

免疫組化染色觀察各組移植腎組織TIPE2表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常腎組織有TIPE2的表達，主要表達在腎小管上皮細胞和浸潤的淋巴細胞，腎小球沒有表達(見圖2)。與對照組(12．19 ±4．8)比較，TIPE2在急性排斥組移植腎組織中表達輕度下降(10．78±3．2，P ＞0．05)，但在慢性排斥組移植腎組織中明顯降低(3．29 ±1．32，P ＜0．05)。

2．4 免疫抑制劑對淋巴細胞TIPE2表達的影響

用RT-PCR檢測免疫抑制劑對人的淋巴細胞TIPE2表達的影響，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素 A可抑制TIPE2表達，并呈現(xiàn)劑量依賴的關系(P＜0．05，);但雷帕霉素對TIPE2的表達沒有影響(P＞0．05);環(huán)孢素A和雷帕霉素合用同樣抑制TIPE2的表達(P ＜0．05，見圖 3)。

3 討論

本研究首次報道了在腎移植術后急、慢性排斥反應患者中TIPE2表達的差異及免疫抑制劑對其表達的影響，急性排斥反應組PBMC中TIPE2表達降低，但慢性排斥反應組TIPE2表達明顯升高。腎移植術后長期存活的患者TIPE2的表達輕度升高。據(jù)此推斷急性排斥的患者PBMCs中TIPE2表達降低，可能是通過調(diào)節(jié)T細胞的活化而促進移植物被排斥。Sun等［7］將TIPE2敲基因小鼠的T細胞和巨噬細胞分離后，發(fā)現(xiàn) T細胞表面的活化性標志物CD25、CD69和CD44表達增高;分別用CD3單克隆抗體和LPS刺激培養(yǎng)，均具有高反應性，分泌高水平的 IL-6、IL-12和 TNF-α，體內(nèi)的 CD4+和 CD8+T細胞的反應性明顯增強，T細胞、B細胞和DC數(shù)量明顯升高，可見機體的免疫狀態(tài)活化，所以TIPE2在免疫負調(diào)控中起非常重要的作用［8］。文獻報道IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β 和 IFN-γ 的基因型和表達頻率直接影響移植腎功能和排斥反應的發(fā)生率［9］。說明急性排斥患者表達TIPE2下調(diào)可能引起患者體內(nèi)的CD4+和CD8+T細胞對供者抗原的高反應性，細胞因子分泌的增高，從而促進排斥反應的發(fā)生。慢性排斥的患者PBMC中TIPE2表達明顯升高，認為慢性移植排斥的過程中，機體的處于免疫活化狀態(tài)，TIPE2代償性增高抑制機體過強的免疫反應。有學者認為，TIPE2含有DED或DED相似的結(jié)構(gòu)域，結(jié)合 caspase-8，促進 Fas誘導的凋亡［7］。但國內(nèi)ZHANG等［10］研究發(fā)現(xiàn)TIPE2結(jié)構(gòu)域是以前沒有報道過的新結(jié)構(gòu)域，它含有一個位于蛋白中心的大疏水腔，認為這個疏水腔可能用于結(jié)合配體，當配體被釋放后可以激活體內(nèi)的免疫反應，從而達到維持免疫動態(tài)平衡的作用。所以對TIPE2進一步研究可能對器官移植排斥發(fā)生發(fā)展的分子機制和對移植排斥干預提供新策略。

圖2 免疫組化和免疫熒光染色檢測TIPE2移植腎組織中的表達(×400)Figure 2 HE and immunohistochemical staining of TIPE2 protein in kidney tissues(×400)

圖3 RT-PCR檢測免疫抑制劑對淋巴細胞TIPE2表達的影響Figure 3 Effect of immunosuppressive agents on TIPE2 expression in lymphocytes

本研究結(jié)果提示，TIPE2在正常腎組織有表達，急性排斥的移植腎組織中表達下降，但慢性排斥移植腎組織中明顯降低，說明TIPE2在急性、慢性排斥中作為一個重要的調(diào)節(jié)分子。文獻報道在移植腎微血管補體C4d片段是抗體介導移植物損傷的標志物，與移植物功能減退和移植物功能喪失有關［11］。我們認為，TIPE2在慢性排斥移植腎組織中降低，可能在移植物長期排斥的過程中抑制T細胞的活化和免疫損傷。此外，慢性排斥腎小管的萎縮可能使TIPE2的表達下降?？傊?，TIPE2與急性、慢性移植排斥反應密切相關，表明TIPE2參與器官移植排斥反應的過程，TIPE2可作為檢測移植排斥反應的分子標志物。

本研究表明環(huán)孢素A可抑制TIPE2表達，并呈現(xiàn)劑量依賴的關系，但雷帕霉素對TIPE2的表達沒有影響。環(huán)孢素A和雷帕霉素聯(lián)合也抑制TIPE2的表達，但環(huán)孢素A抑制TIPE2表達的機制及通過何種信號通路，目前均不清楚。后期我們將會對其進行深入研究，可能對臨床的診斷和治療具有重要的參考價值。

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