張曉嵐1，陳洋，姜奕

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

進(jìn)展期尋常型銀屑病患者皮損中IL-22的表達(dá)

The Expression ofIL-22 in Skin Lesionsof Patientswith Advanced Psoriasis Vulgaris

張曉嵐1，陳洋2，姜奕2

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科，遼寧 錦州 121000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽 110001）

通過應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR以及免疫熒光檢測(cè)方法對(duì)31例進(jìn)展期尋常型銀屑病患者的皮損冰凍標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分析其皮損中的IL-22的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期尋常型銀屑病患者皮損IL-22mRNA的表達(dá)與正常對(duì)照組比較明顯增高（P＜0.05）。因此認(rèn)為，IL-22在進(jìn)展期尋常型銀屑病患者的皮損中呈高表達(dá)，進(jìn)而說明其與尋常型銀屑病的發(fā)病密切相關(guān)。

IL-22；尋常型銀屑病

尋常型銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性的炎癥性皮膚病，發(fā)病率在北方患者中較高［1］，對(duì)于發(fā)病機(jī)制的研究眾多，確切機(jī)制尚不清楚，近年來有部分國外學(xué)者通過大量研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中起到一定的作用［2］，而IL-22是Th17細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子［3］。因此本研究通過應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR以及免疫熒光檢測(cè)方法對(duì)31例進(jìn)展期尋常型銀屑病患者的皮損冰凍標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分析皮損中IL-22的表達(dá)，進(jìn)而揭示IL-22與尋常型銀屑病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

31例進(jìn)展期尋常型銀屑病患者皮損取自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診及病房，通過兩名以上副主任醫(yī)師進(jìn)行確診為進(jìn)展期尋常型銀屑病。取材前均未應(yīng)用維A酸、環(huán)孢素等藥物治療；男20例，女11例，年齡27～88歲［（63.5±17.9）歲］。16例正常對(duì)照組皮膚組織標(biāo)本均取自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚外科患者正常皮損，男9例，女7例；年齡49～78歲［（63.7±8.7）歲］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 設(shè)備及材料：低溫恒冷切片機(jī)（德國leica-CM1900型）；CCD圖像采集相機(jī)；Olmpus光學(xué)顯微鏡（CH，日本）；電熱恒溫水箱（tdw-2002型，河北黃驊航天儀器廠）；-70℃深低溫冰箱（日本Sanyo公司）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（日本TaKaRaTP800型）。鼠抗人IL-22單抗（美國R＆D公司）；驢抗鼠IgG的熒光二抗（美國R＆D公司）；IL-22 Real-time PCR引物、β-actin Real-time PCR引物（上海生工）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)：利用http：//www.ncbi.nlm.nih. gov網(wǎng)站查取了IL-22基因mRNA的序列，通過序列比對(duì)后得到相應(yīng)的基因組序列，從而應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)IL-22基因外顯子區(qū)的實(shí)時(shí)定量PCR所需的引物，并經(jīng)過上海生工公司進(jìn)行合成，其序列如下：IL-22上游引物序列為：ACAACACAGACGTTCGTCTCATTG；IL-22下游引物序列為：GAACAGCACTTCTTCAAGGGTGA；β-actin作為內(nèi)參照基因，上游引物為TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物為CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：（1）提取總RNA：利用TRIZOL溶液和氯仿提取總RNA，并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其純度及濃度，保存于-80℃，將RNA用TaKaRa試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。（2）實(shí)時(shí)定量PCR步驟：按照試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)：25 μL反應(yīng)體系的配制：SYBR Prime Ex Taq（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2.0 μL。IL-22的反應(yīng)條件為：預(yù)變性，95℃30 s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)：變性，95℃5 s，退火，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。IL-22的基因表達(dá)的相對(duì)變化用△△Ct法處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)：OCT包埋標(biāo)本，在冰凍切片機(jī)內(nèi)常規(guī)切片（5 μm），用丙酮固定。標(biāo)本切片滴加PBS液于已知抗原標(biāo)本片，10 min后，滴加PBS適當(dāng)稀釋過的一抗，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋濕盒內(nèi)，在37℃保溫1 h。取出玻片，用PBS溶液反復(fù)沖洗2次，然后按順序過PBS三缸浸泡，每缸需5 min，不時(shí)振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴稀釋后的熒光標(biāo)記的二抗。在37℃內(nèi)保溫1 min。取出玻片，用PBS沖洗2次，然后按照一定順序過PBS三缸浸泡，每缸5 min，不時(shí)振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加1滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定：在熒光顯微鏡高倍視野下觀察，觀察其標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度，一般可用“+”表示：（-）為無熒光；（±）熒光極弱的，視為可疑熒光；（+）為熒光較弱的，但清楚可見；（++）為熒光明亮；（+++～++++）為熒光閃亮。所取的標(biāo)本的強(qiáng)度分級(jí)在200倍的放大倍數(shù)下，由同一個(gè)實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行操作完成質(zhì)量控制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料分析符合正態(tài)分布，用x±s表示，兩樣本均數(shù)間比較利用t檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）以及校正t檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果

進(jìn)展期北方尋常型銀屑病患者與正常對(duì)照組相比較，患者皮損中IL-22 mRNA的相對(duì)表達(dá)量（13.80±3.41）明顯高于正常對(duì)照組（9.26±1.96），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.636，P=0.005），見圖1。

圖1 尋常型銀屑病IL-22的溶解曲線

2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果

免疫熒光法可見，在進(jìn)展期尋常型銀屑病皮損中IL-22高表達(dá)在表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)（圖2），正常對(duì)照組皮損則不表達(dá)IL-22（圖3）。與正常對(duì)照組皮損相比較，尋常型銀屑病皮損中IL-22的表達(dá)明顯升高（χ2=10.44，P＜0.05），見表2。

表2 進(jìn)展期尋常型銀屑病皮損和正常皮膚中IL-22表達(dá)的比較

圖2 在銀屑病表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)IL-22呈熒光強(qiáng)陽性表達(dá) × 200

圖3 正常對(duì)照表皮中IL-22呈熒光陰性表達(dá) ×200

3 討論

銀屑病是一種以鱗屑性紅斑為主要臨床表現(xiàn)的常見復(fù)發(fā)性慢性炎癥性皮膚病，按臨床表現(xiàn)分型為4型，其中尋常型銀屑病最常見，通常認(rèn)為發(fā)病與多基因的遺傳、細(xì)菌或病毒感染、免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)及精神因素等多重方面有關(guān)，其中免疫學(xué)研究為近年來的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)學(xué)說中認(rèn)為Th1細(xì)胞在其發(fā)病中起到重要的作用。而近年來Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)讓國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其與尋常型銀屑病的發(fā)病之間的聯(lián)系進(jìn)行了更多的研究。

IL-22是2000年Renauld等［4］發(fā)現(xiàn)，作為IL-10細(xì)胞因子家族中的一員，也是TH17細(xì)胞中的一個(gè)重要的效應(yīng)分子，由179個(gè)氨基酸殘基相組合［5］，參與人體的免疫功能，與多種免疫性疾病發(fā)病有關(guān)［6，7］。近年來國外學(xué)者通過對(duì)IL-22在尋常型銀屑病患者發(fā)病中所起作用的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)：（1）IL-22通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞，從而降低了促角質(zhì)形成細(xì)胞分化的相關(guān)因子（如角蛋白1、角蛋白10、絲聚合蛋白原、激肽緩解酶7等）的表達(dá)，進(jìn)而抑制了角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化［8，9］。（2）IL-22聯(lián)合TNF-α等細(xì)胞因子促進(jìn)State3的磷酸化并且上調(diào)了Stat3的表達(dá)，從而促進(jìn)尋常型銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增生以及炎性反應(yīng)的形成［10］。同時(shí)IL-22通過上調(diào)了S100A7、S100A8、S100A9的表達(dá)，且誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)β-防御素，抵抗了相關(guān)微生物的侵襲，并抑制了炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而調(diào)控并且維持了表皮細(xì)胞的穩(wěn)定性［11］。（3）IL-22能通過與IL-17、IL-20、IL-23等其他細(xì)胞因子的相互作用，從而起到擴(kuò)大炎性反應(yīng)，促進(jìn)銀屑病棘層增生的作用［12］。（4）IL-22主要在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，但有一部分也可以表達(dá)于表皮成纖維細(xì)胞中［12］，而本實(shí)驗(yàn)在免疫熒光結(jié)果中銀屑病患者皮損的表皮IL-22高表達(dá)，也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

目前，國內(nèi)對(duì)于IL-22與尋常型銀屑病間關(guān)系的研究探討多集中在血清學(xué)檢測(cè)，針對(duì)IL-22在本病患者的皮損中表達(dá)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法及免疫熒光的檢測(cè)技術(shù)對(duì)IL-22在尋常型銀屑病患者和正常對(duì)照組患者的皮損中的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比，從而發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期銀屑病組患者的皮損中IL-22的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），此結(jié)果提示IL-22與尋常型銀屑病患者的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。本研究提出了銀屑病免疫治療的新方向，也提供了基因藥物治療的一個(gè)新思路。

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（編輯武玉欣）

R758.63

A

0258-4646（2015）04-0362-03

張曉嵐（1984-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

姜奕，E-mail：jiangyi@hotmail.com

2014-09-13

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