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（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

上海市豬源沙門氏菌耐藥性及脈沖場凝膠電泳分型研究

寧 昆，張維誼，沈莉萍，徐 峰，齊新永，王 建

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103）

為了解上海地區(qū)豬源沙門氏菌的耐藥性及基因分型情況，本研究對2013年分離到的13株豬源沙門氏菌（10株為豬霍亂沙門氏菌，3株為鼠傷寒沙門氏菌）采用微量肉湯稀釋法進行藥物敏感性測定，應(yīng)用脈沖場凝膠電泳（PFGE）進行基因分型。藥物敏感試驗結(jié)果表明，分離到的13株沙門氏菌對磺胺異惡唑、多西環(huán)素、氟苯尼考和阿莫西林的耐藥率較高，對阿莫西林/棒酸、頭孢曲松、丁胺卡那霉素和頭孢噻呋敏感。脈沖場凝膠電泳分型結(jié)果顯示，10株豬霍亂沙門氏菌中有8株為流行病學相關(guān)，是本次研究中豬霍亂沙門氏菌的優(yōu)勢基因型。

上海；豬；沙門氏菌；耐藥性；脈沖場凝膠電泳

沙門氏菌屬是一群寄生于人和動物腸道內(nèi)的革蘭陰性桿菌，絕大多數(shù)沙門氏菌對人和動物有致病性，具有極其廣泛的宿主譜，是一種重要的人畜共患病病原。不僅引致人的傷寒、副傷寒、急性胃腸炎、敗血癥等疾病，還侵害幼、青年動物，使之發(fā)生敗血癥、胃腸炎及其他組織局部炎癥，對懷孕母畜可致流產(chǎn)，攝入沙門氏菌污染的食物可致人的急性食物中毒[1]。在目前國內(nèi)的畜禽養(yǎng)殖條件下，抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴重，導致細菌的耐藥性不斷加劇和蔓延，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，由此帶來的耐藥問題、食品安全問題及公共衛(wèi)生問題也越來越嚴重[2]。隨著對細菌感染研究的日益深入，傳統(tǒng)的細菌表型分型已不能滿足疾病診斷和流行病學調(diào)查的需要，細菌分子分型正在逐漸取代傳統(tǒng)的表型分型來分析不同來源細菌之間的聯(lián)系，這對細菌的研究具有重要意義[3]。脈沖場凝膠電泳（pulsed-fi eld gel electrophoresis，PFGE）分型方法是對細菌整個染色體進行分析，具有分辨率高、重復性好、結(jié)果穩(wěn)定、易于標準化的特點，被認為是細菌分子分型的金標準，目前在國內(nèi)外被廣泛用于傳染源的追溯、傳播鏈的確認、新的流行菌株的發(fā)現(xiàn)和遺傳變異。本試驗對2013年上海地區(qū)分離到的13株豬源沙門氏菌進行了耐藥性監(jiān)測，并用脈沖場凝膠電泳對其進行了基因分型和流行病學分析。

1 材料

1.1 菌株來源

2013年，從上海市動物疫病預(yù)防控制中心畜禽門診接收的發(fā)病豬中共分離到13株沙門氏菌（表1），由本實驗室完成菌株鑒定并保存

1.2 主要儀器

脈沖場凝膠電泳儀CHEF-mapper、凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR+購自Bio-Rad公司；搖床為德國IKEA公司產(chǎn)品；比濁儀購自法國梅里埃公司。

1.3 主要試劑

藥敏板、12mL MH肉湯管和0.45% NaCl溶液購自天津川禾醫(yī)療科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自Takara公司；PFGE專用瓊脂糖Seakem Gold為LONZA公司產(chǎn)品；蛋白酶K、Tris-HCl、EDTA、SDS購自碧云天生物科技有限公司；TBE緩沖液購自上海索萊寶生物科技有限公司；藥敏質(zhì)控菌株ATCC 25922和PFGE相對分子質(zhì)量標準沙門氏菌全球參考菌株H9812為本實驗室保存。

表1 實驗中沙門氏菌信息

2 方法

2.1 微量肉湯稀釋法

2.1.1 菌液制備。用滅菌棉簽取適量待測菌，懸浮于3mL0.45%NaCl溶液中，用比濁儀調(diào)整細菌濃度，使其麥氏單位達到0.48～0.52，并用ATCC 25922作為試驗質(zhì)控菌株。

2.1.2 菌液接種。首先從12mL肉湯管中吸取100μL加到空白對照孔，然后吸取待測菌液100μL到剩余的12mL肉湯管中，混勻，加100μL到其余各孔。同樣用質(zhì)控菌株操作待測菌。

2.1.3 孵育。將藥敏板置于墊有濕紗布的方瓷盤內(nèi)，36℃溫箱孵育16～18h。

2.1.4 結(jié)果觀察。在襯有黑底板的光線下觀察，無細菌生長的孔內(nèi)所含最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

2.2 PFGE方法

2.2.1 細菌處理。用滅菌棉簽取適量細菌，懸浮于1mLCSB溶液中，用比濁儀調(diào)整細菌的濃度，使其麥氏單位達到4.5～5.0。

2.2.2 制備膠塊。取200μL細菌懸浮液于2mL Eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5 min。每管加入終濃度為0.5mg/mL蛋白酶K并加入200μL已融化并在56℃水浴平衡的1%的Seakem Gold瓊脂糖溶液（含1% SDS），用移液器加入膠塊制備模具。

2.2.3 細菌裂解。在50mL的離心管中加入5mL的CLB，然后再加入25μL濃度為20mg/mL蛋白酶K，從模具中取出細菌包埋膠塊放入到離心管中，55 ℃搖床中孵育6h，搖床轉(zhuǎn)速為170r/min。

2.2.4 洗滌膠塊。倒掉混合液，加入15mL 50℃預(yù)熱的去離子水，50 ℃搖床洗滌10min，洗滌2次，用TE緩沖液同樣條件洗滌4次。

2.2.5 XbaⅠ酶切。在2mL Eppendorf管中加入200μL膠塊平衡液，將洗滌過的膠塊切成2mm寬的膠條，放入膠塊平衡液中，37℃孵育10min，棄平衡液，加入200μL酶切溶液（175μL去離子水：20μL M Buffer：5μL XbaⅠ酶），37℃孵育12 h，棄酶切液。加入200μL 0.5×TBE電泳緩沖液平衡5min。

2.2.6 加樣。第1，5，10齒各加1個H9812菌膠塊作為Marker。將梳子放入膠槽，緩慢倒入100 mL在60℃水浴平衡半小時以上的1 % Seakem Gold瓊脂糖溶液。

2.2.7 電泳。加2.2L 0.5×TBE電泳緩沖液，電泳時間19h，電泳溫度為14℃。

2.2.8 染色。電泳后將膠放入Gelred染液中染色30min，然后用去離子水脫色1h。

2.2.9 成像及分析。用凝膠成像儀成像并將結(jié)果用BioNumerics分析軟件進行分析。

3 結(jié)果

表2 藥敏試驗結(jié)果

圖1 部分沙門氏菌的PFGE結(jié)果

3.1 藥敏試驗

本次試驗中質(zhì)控菌株及空白對照均成立，其余待測菌試驗結(jié)果見表2，發(fā)現(xiàn)13株豬源沙門氏菌對一些抗生素耐藥率較高，其中磺胺異惡唑為92.31%，多西環(huán)素為84.62%，阿莫西林為69.23%，氨芐西林為61.54%，對阿莫西林/棒酸、頭孢曲松、丁胺卡那霉素和頭孢噻呋敏感。

3.2 脈沖場凝膠電泳

13株沙門氏菌經(jīng)XbaⅠ酶切，PFGE電泳后，每個菌株產(chǎn)生13到18條電泳條帶，部分菌株的PFGE結(jié)果見圖1。

3.3 PFGE聚類分析結(jié)果

用BioNumerics軟件對13株豬源沙門氏菌進行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，10株豬霍亂沙門氏菌相似度在60%～100%，共分3個基因型，其中A型有8株（占總數(shù)的80%），其相似度在85%以上，B型1株，C型1株。Tenover認為由于細菌具有變異性，在PFGE圖譜分析中，相似值在0.85以上的菌株可以判斷是流行病學相關(guān)，這種方法能夠用于分析菌株之間的相關(guān)性[4]。其余的3株鼠傷寒沙門氏菌帶型差別較大，由于菌株數(shù)量較少，無法推測其優(yōu)勢基因型。

4 討論

脈沖場凝膠電泳被認為是細菌分子分型的金標準。美國疾病預(yù)防控制中心于1996年建立了標準的PFGE方法，成立了監(jiān)測食源性微生物的分子分型網(wǎng)絡(luò)。我國疾病預(yù)防控制中心于2004年成立了中國病原菌分子分型實驗室監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。這些監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)對疾病的預(yù)測預(yù)警、追蹤溯源等起到了很大作用[5]，國內(nèi)外很多學者也進行了這方面的研究。Kubota于2005年首次在國際范圍內(nèi)用PFGE技術(shù)對來自31個國家地區(qū)的131株傷寒沙門氏菌進行了流行病學調(diào)查，得到了79個PFGE基因型[6]。紀惠玲試驗研究了PFGE 技術(shù)在鼠傷寒沙門氏菌分型中的應(yīng)用，并成功地將13株鼠傷寒沙門氏菌分為10個PFGE 基因型[7]。這些都表明PFGE分型方法已在細菌分子分型中得到廣泛應(yīng)用，是沙門氏菌分子流行病學較好的基因分型方法。

圖2 13株豬源沙門氏菌聚類分析

細菌的PFGE基因分型按照Tenover等用相似度進行同源性分析的解釋，認為相似度85%，菌株是高度同源，可能來自同一克隆株，即成流行病學相關(guān)性；相似度 50%的菌株被認為是流行病學不相關(guān)，相似度介于兩者之間被認為相似菌株[4]。按照這一判定標準，本研究中的豬霍亂沙門氏菌有8株同源性在85%以上，可能來自同一克隆株，成流行病學相關(guān)性，我們定義為A帶型，其數(shù)量占到總數(shù)的80%，由此我們也推測A帶型可能為上海地區(qū)豬霍亂沙門氏菌的優(yōu)勢基因型。由于分離到的鼠傷寒沙門氏菌數(shù)量較少，從分型結(jié)果來看還不能找到優(yōu)勢基因型，此方面還有待進一步研究。

藥敏試驗結(jié)果顯示，分離到的沙門氏菌耐藥現(xiàn)象比較嚴重，耐藥率較高的藥物為磺胺異惡唑、多西環(huán)素、氟苯尼考和阿莫西林，耐藥率分別達到92.31%、84.62%、76.92%和69.23%，這可能與臨床藥物使用不規(guī)范有關(guān)，因此在臨床中應(yīng)避免或減少使用已明顯耐藥的這幾種藥物。丁胺卡那霉素、頭孢曲松、頭孢噻呋和阿莫西林/棒酸對試驗的沙門氏菌效果很好，說明在治療上海地區(qū)豬源沙門氏菌感染時可作為首選藥物。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[2] 唐攀，崔恩慧，劉萬華，等. 雞源沙門氏菌PFGE分型及耐藥性研究[J]. 動物醫(yī)學進展，2013，34（11）：1-5.

[3] 陳瑞，訾占超，石佩，等. 雞沙門氏菌脈沖場凝膠電泳分型研究[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2009，31（11）：846-849.

[4] Tenover F C，Arbeit R D，Goering R V，et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-fi eld gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing[J]. J Clin Microbiol，1995，33（9）：2233-2239.

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[6] Kubota K，Barrett T J，Ackers M L，et al. Analysis of Salmonella enterica Serotype Typhi Pulsed-Field Gel Electrophoresis Patterns Associated with International Travel[ J ]. J Clin M icrobiol，2005，43（3）：1205- 1209.

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Research on Drug-resistance and Genotyping of Salmonella from Pig in Shanghai by Pulsed-fi eld Gel Electrophoresis

Ning Kun，Zhang Weiyi，Shen Liping，Xu Feng，Qi Xinyong，Wang Jian
（Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103）

To investigate the drug-resistance and genotype of Salmonella from pig in Shanghai，13 Salmonella isolates（10 Salmonella choleraesuis，3 Salmonella typhimurium）were tested for their drug-resistance using broth dilution method，and genotyped by pulsed-fi eld gel electrophoresis（PFGE）. Drug-resistance test showed that the 13 Salmonella isolates were resistant to sulfisoxazole，doxycycline，florfenicol and amoxicillin，and sensitive to amoxicillin/clavulanic acid，ceftriaxone，amikacin and ceftiofur. Pulsed-fi eld gel electrophoresis typing showed that 8 Salmonella choleraesuis were epidemiologically linked，and were the dominant genotype in our study.

Shanghai；swine；Salmonella；drug-resistance；pulsed-fi eld gel electrophoresis

R378.22；S828

：A

：1005-944X（2015）02-0079-04

滬農(nóng)科攻字（2011）第4-9號

王建