韓芙蓉，王令,2，徐坤，張智英，王昕. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 7200；2. 陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

基于SSA修復(fù)機制和特異性核酸酶活性檢測的雙熒光報告載體系統(tǒng)的開發(fā)及應(yīng)用

韓芙蓉1，王令1,2，徐坤1，張智英1，王昕1
1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，楊凌 712100；2. 陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000

報告載體系統(tǒng)因構(gòu)建快捷、改造簡單、操作容易、經(jīng)濟有效，并且能通過介導(dǎo)篩選核酸酶陽性細(xì)胞富集基因組修飾的陽性細(xì)胞克隆，而成為特異性核酸酶活性檢測的重要手段。基于非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)修復(fù)機制的報告系統(tǒng)在引入DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)后，經(jīng)過優(yōu)化最高也只有2/3的概率實現(xiàn)報告基因的修復(fù)；而單鏈退火(Single strand annealing，SSA)修復(fù)機制在引入DSBs后，理論上可以實現(xiàn)報告基因 100%的修復(fù)，具有更高的靈敏度，有利于活性較低的特異性核酸酶活性的檢測，為基因組修飾研究中特異性核酸酶活性的檢測提供了有效的手段。本研究設(shè)計并構(gòu)建了 3套基于SSA修復(fù)機制的雙熒光報告載體系統(tǒng)，并應(yīng)用mRFP-eGFP系統(tǒng)檢測了3對ZFNs的有效活性，其活性檢測結(jié)果分別為8.9%、9.3%和5.0%，該研究為核酸酶活性的檢測提供了有效的手段。

SSA；雙熒光報告載體系統(tǒng)；特異性核酸酶

基因組編輯的傳統(tǒng)方法有自發(fā)同源重組和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法，但應(yīng)用效果不佳。DNA雙鏈斷裂(Double strand breaks，DSBs)切口修復(fù)機制的發(fā)現(xiàn)使其發(fā)生了巨大變革[1]。DSBs能激活細(xì)胞內(nèi)的多種DNA斷裂修復(fù)機制，其中主要有同源重組(Homologous recombination, HR)、非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)和單鏈退火(Single strand annealing，SSA)三種方式。Bibikova等[2]發(fā)現(xiàn)在基因組特殊位點產(chǎn)生DSBs，能提高基因組編輯的靶向性和精確性，同時能將哺乳動物細(xì)胞中 HR介導(dǎo)的基因組編輯效率提高到5×104。研究表明，在基因組中利用大范圍核酸酶 (Meganuclease) I-Sce I產(chǎn)生DSBs能夠顯著提高哺乳動物基因組的靶向修飾效率[3～5]。但由于大范圍核酸酶改造困難，因此相對較容易改造的鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)[6,7]、類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like (TAL) effector nucleases, TALENs)[8,9]和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)技術(shù) CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR- associated proteins )[10～12]作為有效的基因打靶工具相繼應(yīng)運而生。這些位點特異性的核酸內(nèi)切酶能夠根據(jù)DNA靶序列進行改造，改造后的核酸內(nèi)切酶能夠特異識別和切割目標(biāo) DNA靶序列[13]，產(chǎn)生DSBs。在沒有供體DNA和同源序列存在的情況下，細(xì)胞基因組DNA上的DSBs一般通過NHEJ機制進行修復(fù)，修復(fù)之后會產(chǎn)生少數(shù)堿基的插入或缺失(Insertions and deletions, Indels)。通過檢測相應(yīng)靶序列上 Indels來衡量特異性核酸酶的工作效率。Indels的檢測方法主要有錯配DNA內(nèi)切酶法(T7E-I 或 CEL-I)、T-A克隆測序法和高通量測序法，但這些方法不夠直觀，工作量大或費用較高。因此，針對特異性核酸酶活性檢測的報告系統(tǒng)逐漸興起。

所有的報告系統(tǒng)都是基于特殊的報告基因，如抗生素抗性基因、編碼熒光蛋白和熒光素酶的基因等。將特異性核酸酶的靶序列插入報告基因的開放閱讀框內(nèi)(Open reading frame，ORF)，使其無法正確表達相應(yīng)的功能蛋白，在特異性核酸酶的作用下，報告基因中插入的靶序列被靶向切割形成DSBs, 進而根據(jù)研究人員的設(shè)計激活細(xì)胞內(nèi)源的NHEJ、SSA 或HR等修復(fù)機制，實現(xiàn)對報告基因ORF的修復(fù)。報告系統(tǒng)具有易觀察、易檢測等優(yōu)點。

在哺乳動物細(xì)胞水平，用于特異性核酸酶活性檢測的報告系統(tǒng)主要包括報告細(xì)胞系和報告載體。細(xì)胞中報告基因的存在方式有兩種：一種是直接在細(xì)胞基因組中整合報告基因構(gòu)件，獲得相應(yīng)的報告細(xì)胞系[14]；另一種是構(gòu)建含報告基因元件的報告載體，與特異性核酸酶表達載體共轉(zhuǎn)染至哺乳動物細(xì)胞實現(xiàn)對核酸酶活性的檢測，此時細(xì)胞內(nèi)的報告基因游離存在[15]。雖然報告載體并未整合入細(xì)胞基因組，不是很穩(wěn)定，但是相對于報告細(xì)胞系，具有明顯的優(yōu)勢：首先構(gòu)建快捷，靶序列易于改變；其次無需進行基因組整合，操作簡易；最后能應(yīng)用于特異性核酸酶陽性細(xì)胞的篩選，進而實現(xiàn)對基因組修飾陽性細(xì)胞的富集甚至對陽性細(xì)胞克隆的篩選。

為了便于觀察和檢測，一般將編碼熒光蛋白的基因作為報告基因。2011年，Kim等[15]首次將紅色熒光蛋白mRFP與綠色熒光蛋白eGFP融合表達，在二者的編碼基因序列之間插入 ZFNs靶序列，構(gòu)建得到了mRFP-eGFP雙熒光報告載體。其中，mRFP作為衡量轉(zhuǎn)染效率的標(biāo)記基因正確表達，而 eGFP作為報告基因其閱讀框發(fā)生移碼突變，不能正常表達。當(dāng)ZFNs切割靶序列并引入DSBs后，會激活細(xì)胞內(nèi)NHEJ修復(fù)機制，使eGFP的閱讀框發(fā)生重排，以 1/3的概率表達出有功能的綠色熒光蛋白。通過eGFP陽性細(xì)胞的比例衡量ZFNs的工作效率，并進一步利用流式細(xì)胞儀分選得到mRFP和eGFP雙陽性細(xì)胞，實現(xiàn)對基因組修飾陽性細(xì)胞的富集[15]。由于該mRFP-eGFP雙熒光報告載體采用了NHEJ的修復(fù)機制，因此最高只有 1/3的概率實現(xiàn)報告基因的修復(fù)，效率有限；尤其是針對活性較低的特異性核酸酶時并不理想。2013年，Kim教授研究團隊進一步對該mRFP-eGFP雙熒光報告載體進行了優(yōu)化，引入了兩個eGFP報告基因閱讀框，使其在DSBs引入后的理論修復(fù)概率提高到2/3[16]。

本研究團隊于2012年首次提出了基于SSA修復(fù)機制的特異性核酸酶活性檢測報告載體系統(tǒng)，并進行了一系列的嘗試和應(yīng)用研究[17～19]，為以后特異性核酸酶的應(yīng)用、基因組修飾陽性細(xì)胞克隆的篩選等研究奠定了基礎(chǔ)。SSA是一種重要的DNA重組方式，當(dāng)在 DSBs兩側(cè)有一定長度的正向重復(fù)序列時被激活，通過同源重組實現(xiàn) DSBs修復(fù)，并刪除一個正向重復(fù)序列。理論上DSBs引入后，基于SSA修復(fù)機制的報告基因的修復(fù)效率能達到100%。本文主要介紹了3種不同的基于SSA修復(fù)機制的雙熒光報告載體系統(tǒng)的設(shè)計開發(fā)、功能驗證和初步的應(yīng)用研究。

1 材料和方法

1.1 材料

DH5α感受態(tài)細(xì)胞，人胚腎細(xì)胞系HEK293T，質(zhì)粒pST1374-Sharky、pDsRed1-C1、pcDNA3-mRFP、peGFP-C1以及3對ZFNs酵母表達載體pLeu-ZFNLs 和pTrp-ZFNRs均由實驗室保存或前期工作構(gòu)建。

1.2 ZFNs真核表達載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ和 BamHⅠ雙酶切載體pST1374-Sharky及pLeu-ZFNL，瓊脂糖凝膠分離后純化獲得線性化骨架及300 bp大小的編碼3鋅指蛋白的片段，用T4連接酶16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于抗性LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)，10 h后挑取單克隆，酶切鑒定陽性克隆，獲得ZFNs哺乳動物細(xì)胞表達載體pST-ZFNL。同時，用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ雙酶切載體pST1374-Sharky及pLeu-ZFNR，以同樣的流程構(gòu)建獲得載體pST-ZFNR。采用上述方法，分別構(gòu)建了3 對 ZFNs的真核表達載體 pST-ZFNL1/2/3和pST-ZFNR1/2/3。

1.3 DsRed-eGFP報告載體系統(tǒng)

1.3.1 DsRed-eGFP報告載體系統(tǒng)的設(shè)計

DsRed-eGFP報告載體中，紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白融合表達，由同一個啟動子控制；其中紅色熒光蛋白基因DsRed作為標(biāo)記基因用于衡量轉(zhuǎn)染效率，綠色熒光蛋白基因 eGFP作為報告基因用于檢測特異性核酸酶的工作效率；eGFP基因閱讀框被核酸酶靶序列打斷并分成兩部分，前后各含300 bp的正向重復(fù)序列，當(dāng)核酸酶發(fā)揮作用并在靶序列上引入DSBs后，激活細(xì)胞內(nèi)的SSA修復(fù)機制，實現(xiàn)eGFP基因閱讀框的修復(fù)和綠色熒光蛋白的正常表達。1.3.2 pDsRed-eGFP-BS報告載體的構(gòu)建

從質(zhì)粒 peGFP-C1中利用不同的引物序列，分別擴增得到片段eGFPL和eGFPR。前者經(jīng)Bgl II和SalⅠ雙酶切后插入載體 pDsRed1-C1中，獲得中間載體pDsRed-eGFPL；后者用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后插入上述中間載體中，得到不含靶序列的報告載體pDsRed-eGFP-MCS，其中eGFP基因閱讀框被NotⅠ和 BamHⅠ的多克隆位點和正向重復(fù)序列打斷。通過引物退火作用獲得兩端為NotⅠ和BamHⅠ粘性末端的ZFNs靶序列片段，克隆至載體pDsRedeGFP-MCS中，進而得到含有相應(yīng)靶序列的報告載體pDsRed-eGFP-BS。同時構(gòu)建DsRed-eGFP正常表達的野生型陽性對照載體pDsRed-eGFP。

1.4 eGFP-DsRed報告載體系統(tǒng)

1.4.1 eGFP-DsRed報告載體系統(tǒng)的設(shè)計

eGFP-DsRed報告載體系統(tǒng)與上述DsRed-eGFP系統(tǒng)設(shè)計的不同之處在于：(1) eGFP-DsRed系統(tǒng)改用 eGFP作為標(biāo)記基因用來衡量轉(zhuǎn)染效率，而報告基因則相反地采用了紅色熒光蛋白基因 DsRed，同樣采用SSA修復(fù)機制；(2) eGFP-DsRed系統(tǒng)在eGFP 和DsRed基因引入了核糖體結(jié)合位點(Internal ribosome entry site，IRES)，保證在同一個CMV啟動子控制下eGFP和DsRed基因能以非融合的形式各自單獨表達。而DsRed-eGFP系統(tǒng)中eGFP和DsRed作為一個融合蛋白表達。

1.4.2 peGFP-DsRed-BS報告載體的構(gòu)建

從質(zhì)粒pDsRed1-C1中利用不同的引物序列，分別通過 Overlap PCR和普通 PCR擴增得到片段IRES-DsRedL和DsRedR。將兩個片段先后依次克隆到 peGFP-C1中，構(gòu)建得到不含靶序列的報告載體peGFP-DsRed-MCS，其中DsRed基因閱讀框被NotⅠ和BamHⅠ的多克隆位點和300 bp的正向重復(fù)序列打斷。通過引物退火作用獲得兩端為NotⅠ和BamHⅠ粘性末端的 ZFNs靶序列片段，克隆至載體peGFP-DsRed-MCS中，得到含有相應(yīng)靶序列的報告載體peGFP-DsRed-BS。同時構(gòu)建eGFP-DsRed正常表達的野生型陽性對照載體peGFP-DsRed。

1.5 mRFP-eGFP報告載體系統(tǒng)

1.5.1 mRFP-eGFP報告載體系統(tǒng)的設(shè)計

mRFP-eGFP報告載體系統(tǒng)采用紅色熒光蛋白基因mRFP替代了上述DsRed-eGFP報告載體系統(tǒng)中的DsRed基因，作為標(biāo)記基因用于衡量轉(zhuǎn)染效率；與 DsRed-eGFP系統(tǒng)一樣，采用 SSA修復(fù)機制的eGFP報告基因在紅光基因下游融合表達，用于檢測特異性核酸酶的工作效率。

1.5.2 pmRFP-eGFP-BS報告載體的構(gòu)建

從 pcDNA3-mRFP中擴增大小約為 680 bp的mRFP片段，用AgeⅠ和BglⅡ雙酶切純化的mRFP基因片段及骨架載體 pDsRed-eGFP-MCS/BS，然后將mRFP基因片段克隆至骨架載體中，替代掉原來的DsRed基因片段，獲得相應(yīng)的雙熒光報告載體pmRFP-eGFP-MCS/BS。以相同方式在載體pDsRed-eGFP的基礎(chǔ)上，替換掉DsRed基因片段，構(gòu)建mRFP-eGFP正常表達的野生型陽性對照載體pmRFP-EGFP。

1.6 三種報告載體系統(tǒng)的功能驗證

通過對實驗室前期篩選得到的 3對 ZFNs[17,20]進行活性檢測，對以上 3種報告載體系統(tǒng)進行功能驗證。具體操作如下：將HEK293T細(xì)胞系復(fù)蘇后傳代至24孔板，按常規(guī)程序正常培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達到70%～80%時，更換新鮮培養(yǎng)基，2～4 h后進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染(每孔總DNA量為1.6 μg，ZFNL, ZFNR表達載體和報告載體的轉(zhuǎn)染比率為 1.2:1.2:1，選擇Sofast轉(zhuǎn)染試劑，按照廈門太陽馬生物公司說明書步驟操作)。將含有靶序列的雙熒光報告載體和ZFNs表達載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，作為實驗組檢測相應(yīng) ZFNs的工作效率。同時設(shè)置兩組對照，一組轉(zhuǎn)染報告載體和空的 ZFNs表達載體，另一組只轉(zhuǎn)染雙熒光均正常表達的野生型陽性對照載體。實驗組和對照組，每組設(shè)置3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染后24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后觀察熒光情況并拍照，72 h后收集細(xì)胞，進行流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)檢測。對3種報告載體系統(tǒng)的功能驗證過程進行多次重復(fù)，觀察并統(tǒng)計結(jié)果。

圖1 DsRed-eGFP雙熒光報告載體系統(tǒng)

2 結(jié)果與分析

2.1 DsRed-eGFP報告載體系統(tǒng)的功能驗證

將報告載體pDsRed-eGFP-BS和ZFNs表達載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，ZFNs在細(xì)胞內(nèi)表達后特異性的識別并切割靶序列，啟動細(xì)胞SSA修復(fù)機制的原理見圖1A。轉(zhuǎn)染后48 h，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，發(fā)現(xiàn)不同處理組紅色熒光均十分微弱，陰性對照組和實驗組的綠色熒光基本不可見，而陽性對照組綠色熒光較強(圖 1B)?？赡苁且驗镈sRed信號本身就弱于eGFP，導(dǎo)致紅色熒光比綠色熒光微弱，甚至不可見；其次 DsRed-eGFP系統(tǒng)中DsRed和eGFP融合表達，影響了兩種蛋白的空間結(jié)構(gòu)和熒光特性，且對DsRed的影響相對嚴(yán)重。結(jié)果說明DsRed-eGFP系統(tǒng)中以DsRed衡量轉(zhuǎn)染效率，不利于下游 eGFP工作效率的觀察與檢測，因此我們對此系統(tǒng)進行改造與優(yōu)化，更有利于實現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中對特異性核酸酶活性的有效檢測。

2.2 eGFP-DsRed報告載體系統(tǒng)的功能驗證

根據(jù)2.1的結(jié)果推測，DsRed-eGFP系統(tǒng)中DsRed 和eGFP融合表達對DsRed的影響嚴(yán)重。因此本研究隨后又構(gòu)建了 eGFP-DsRed系統(tǒng)，同時在 DsRed 和eGFP之間引入了IRES，期望實現(xiàn)DsRed和eGFP以非融合蛋白的形式表達。

將報告載體peGFP-DsRed-BS和ZFNs表達載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，ZFNs在細(xì)胞內(nèi)表達后特異性的識別并切割靶序列，啟動細(xì)胞SSA修復(fù)機制的原理見圖2A。轉(zhuǎn)染后48 h，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，發(fā)現(xiàn)不同處理組細(xì)胞中均有較多的綠色熒光，陽性對照組中有較少的紅色熒光細(xì)胞，而陰性對照和實驗組細(xì)胞中紅色熒光幾乎不可見(圖 2B)。究其原因可能有以下幾點：首先 IRES啟動翻譯的活力有限，DsRed蛋白比eGFP蛋白的表達量相對較少；其次與eGFP相比，DsRed基因的表達活力或DsRed蛋白的活性較低；第三用于功能驗證的 ZFNs的工作效率較低，導(dǎo)致實驗組未能有效檢測到紅色熒光細(xì)胞。因此， eGFP-DsRed系統(tǒng)仍不能實現(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中對特異性核酸酶活性的有效檢測。

圖2 eGFP-DsRed雙熒光報告載體系統(tǒng)

2.3 mRFP-eGFP報告載體系統(tǒng)的功能驗證及初步應(yīng)用

基于上述DsRed-eGFP和eGFP-DsRed系統(tǒng)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn) DsRed無論是作為標(biāo)記基因與eGFP融合表達，還是作為報告基因并借助于IRES 與eGFP分開表達，其表達情況均不理想，紅色熒光強度始終很低。因此，我們進一步嘗試用具有較高活性的紅色熒光蛋白基因mRFP替代了DsRed-eGFP系統(tǒng)中的DsRed基因，構(gòu)建mRFP-eGFP系統(tǒng)，其中mRFP作為標(biāo)記基因并與報告基因eGFP融合表達。

將報告載體pmRFP-eGFP-BS和ZFNs表達載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，ZFNs在細(xì)胞內(nèi)表達后特異性的識別并切割靶序列，啟動細(xì)胞SSA修復(fù)機制的原理見圖3A。轉(zhuǎn)染后48 h，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況(圖 3B)：不同處理組細(xì)胞中均有較多的紅色熒光，說明mRFP作為標(biāo)記基因正常表達；陽性對照組中紅色熒光和綠色熒光均很明顯，說明mRFP-eGFP融合表達不影響二者的熒光特性；陰性對照組中只能觀察到紅色熒光，說明 mRFP-eGFP系統(tǒng)中eGFP報告基因沒有明顯的自修復(fù)；3對ZFNs的實驗組中均觀察到了綠色熒光細(xì)胞，說明mRFP-eGFP報告系統(tǒng)工作；而綠色熒光細(xì)胞較少，這與實驗中所使用的ZFNs的活性直接相關(guān)。

轉(zhuǎn)染后72 h，繼續(xù)觀察不同處理組細(xì)胞熒光情況，結(jié)果如圖4A所示：陽性對照組中紅色熒光和綠色熒光均有所增強；陰性對照組中出現(xiàn)少量綠色熒光細(xì)胞；實驗組中綠色熒光細(xì)胞數(shù)量有所增加，且熒光強度增大。結(jié)果說明mRFP-eGFP系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)在哺乳動物細(xì)胞中對特異性核酸酶活性的有效檢測。

為了量化實驗結(jié)果，更為精確地反應(yīng)所檢測的核酸酶的活性情況，我們進一步采用了流式細(xì)胞術(shù)對熒光細(xì)胞進行了計數(shù)檢測，相應(yīng)結(jié)果用 FCS express 4軟件分析，數(shù)據(jù)如圖4B所示。最后以紅色熒光和綠色熒光雙陽性細(xì)胞的比率來衡量所檢測ZFNs核酸酶的活性。具體計算方法如下：(1) 相對雙熒光陽性細(xì)胞率=雙熒光陽性細(xì)胞率/(雙熒光陽性細(xì)胞率+紅色熒光陽性細(xì)胞率)×100%；(2) 所檢測核酸酶活性=實驗組雙熒光陽性細(xì)胞率?陰性對照組雙熒光陽性細(xì)胞率。相關(guān)計數(shù)結(jié)果如表 1所示：所檢測3對ZFNs (ZFN1、ZFN2和ZFN3)的活性分別為8.9%，9.3%和5.0%。

圖3 mRFP-eGFP雙熒光報告載體系統(tǒng)

3 討 論

近10年來，隨著基因組定點打靶技術(shù)的發(fā)展，ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9等位點特異性核酸酶相繼應(yīng)運而生，同時特異性核酸酶活性的檢測手段也在不斷發(fā)展進步。其中，報告載體系統(tǒng)由于構(gòu)建快捷、改造簡單、操作容易、經(jīng)濟有效、能夠通過介導(dǎo)篩選核酸酶陽性細(xì)胞實現(xiàn)對基因組修飾后的陽性細(xì)胞克隆進行富集和篩選等優(yōu)點，逐漸被研究工作者們所采用。

鑒于特異性核酸酶活性傳統(tǒng)的檢測手段(如T7E-I檢測)主要是針對NHEJ修復(fù)機制所引入的Indels的檢測，基于 NHEJ修復(fù)機制的報告載體系統(tǒng)被充分重視并被廣泛應(yīng)用，而基于HR和SSA修復(fù)機制的報告載體系統(tǒng)則鮮有報道。

采用SSA修復(fù)機制則在引入DSBs后理論上可以實現(xiàn)報告基因100%的修復(fù)，因此具有更高的靈敏度，有利于活性較低的特異性核酸酶活性的檢測。我們研究團隊對基于SSA修復(fù)機制的報告載體系統(tǒng)進行了一系列的嘗試和應(yīng)用研究[17～19]。本研究先后嘗試設(shè)計并構(gòu)建了基于SSA修復(fù)機制的DsRed-eGFP系統(tǒng)、eGFP-DsRed系統(tǒng)和mRFP-eGFP系統(tǒng)；最終成功應(yīng)用 mRFP-eGFP系統(tǒng)實現(xiàn)了對實驗室自主篩選構(gòu)建的3對ZFNs的活性檢測，其活性檢測結(jié)果分別為8.9%、9.3%和5.0%。在后續(xù)的研究中，我們對DsRed-eGFP系統(tǒng)進行了優(yōu)化，將DsRed和eGFP用不同的啟動子各自單獨表達；同時為了降低報告載體的自修復(fù)效率，減短用于介導(dǎo)SSA修復(fù)機制的正向重復(fù)序列為 200 bp；最終實現(xiàn)了對一系列 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)活性的高效檢測(最高達40%)[19]。但是由于所采用的核酸酶不同、流式細(xì)胞術(shù)檢測的參數(shù)不同，上述雙熒光報告系統(tǒng)之間并不能進行有效的比較。

圖4 應(yīng)用mRFP-eGFP雙熒光報告載體系統(tǒng)檢測ZFNs活性

表1 應(yīng)用mRFP-eGFP雙熒光報告載體系統(tǒng)檢測ZFNs活性的結(jié)果

Kuhar等[21]最新開發(fā)的新型報告系統(tǒng)采用了NHEJ、HR和SSA三種修復(fù)機制并進行了詳細(xì)的比較，發(fā)現(xiàn)SSA的效率是NHEJ的10倍以上。同時，本實驗室在進一步的研究中分別開發(fā)了基于 NHEJ 和SSA修復(fù)機制的DsRed-PuroR-eGFP (RPG)雙熒光雙報告基因系統(tǒng)，通過比較證明了SSA-RPG系統(tǒng)比NHEJ-RPG系統(tǒng)具有更高的靈敏度，且SSA同源臂的最優(yōu)長度為200 bp[18]。

本研究通過對3種不同設(shè)計的SSA雙熒光報告載體系統(tǒng)的嘗試，成功獲得了能夠應(yīng)用于特異性核酸酶活性檢測的mRFP-eGFP系統(tǒng)，并初步應(yīng)用該系統(tǒng)實現(xiàn)了對3對ZFNs活性的有效檢測；該系統(tǒng)比基于 NHEJ的雙熒光報告載體系統(tǒng)具有更高的靈敏度，為后續(xù)報告系統(tǒng)的改造和設(shè)計提供了經(jīng)驗和借鑒，也為以后基因組修飾研究中特異性核酸酶活性的檢測提供了有效的手段。

[1] Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus MH, Chandrasegaran S. Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells. Nucleic Acids Res, 2005, 33(18): 5978-5990.

[2] Bibikova M, Carroll D, Segal DJ, Trautman JK, Smith J, Kim YG, Chandrasegaran S. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases. Mol Cell Biol, 2001, 21(1): 289-297.

[3] Choulika A, Perrin A, Dujon B, Nicolas JF. Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 1995, 15(4): 1968-1973.

[4] Plessis A, Perrin A, Haber JE, Dujon B. Site-specific recombination determined by I-SceI, a mitochondrial group I intron-encoded endonuclease expressed in the yeast nucleus. Genetics, 1992, 130(3): 451-460.

[5] Bellaiche Y, Mogila V, Perrimon N. I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila. Genetics, 1999, 152(3): 1037-1044. [6] Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(3): 1156-1160.

[7] Choo Y, Isalan M. Advances in zinc finger engineering. Curr Opin Struct Biol, 2000, 10(4): 411-416. Christian M, Cermak T, Doyle EL, Schmidt C, Zhang F, Hummel A, Bogdanov AJ, Voytas DF. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics, 2010, 186(2): 757-761.

[8] Nemudryi AA, Valetdinova KR, Medvedev SP, Zakian SM. TALEN and CRISPR/Cas genome editing systems: tools of discovery. Acta Naturae, 2014, 6(3): 19-40.

[9] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[10] Cong L, Ran FA, Cox D, Lin SL, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu XB, Jiang WY, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[11] Mali P, Yang LH, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013, 339(6121): 823-826.

[12] 吳金青, 梅瑰, 劉志國, 陳瑤生, 叢佩清, 何祖勇. 應(yīng)用SSA報告載體提高ZFN和CRISPR/Cas9對豬IGF2基因的打靶效率. 遺傳, 2015, 37(1): 55-62.

[13] Porteus MH, Baltimore D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science, 2003, 300(5620): 763.

[14] Kim H, Um E, Cho SR, Jung C, Kim H, Kim JS. Surrogate reporters for enrichment of cells with nuclease-induced mutations. Nat Methods, 2011, 8(11): 941-943.

[15] Ramakrishna S, Cho SW, Kim S, Song M, Gopalappa R, Kim JS, Kim H. Surrogate reporter-based enrichment of cells containing RNA-guided Cas9 nuclease-induced mutations. Nat Commun, 2014, 5: 3378.

[16] Wang L, Lin J, Zhang TT, Xu K, Ren CH, Zhang ZY. Simultaneous screening and validation of effective zinc finger nucleases in yeast. PLoS One, 2013, 8(5): e64687.

[17] Ren CH, Xu K, Liu ZT, Shen JC, Han FR, Chen ZL, Zhang ZY. Dual-reporter surrogate systems for efficient enrichment of genetically modified cells. Cell Mol Life Sci, 2015, 72(14): 2763-2772.

[18] Xu K, Ren CH, Liu ZT, Zhang TT, Li D, Wang L, Yan Q, Guo LJ, Shen JC, Zhang ZY. Efficient genome engineering in eukaryotes using Cas9 from Streptococcus thermophilus. Cell Mol Life Sci, 2015, 72(2): 383-399.

[19] 王令. 鋅指核酸酶的構(gòu)建及其在動物基因組編輯中的應(yīng)用[學(xué)位論文]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2013.

[20] Kuhar R, Gwiazda KS, Humbert O, Mandt T, Pangallo J, Brault M, Khan I, Maizel N, Rawlings DJ, Scharenberg AM, Certo MT. Novel fluorescent genome editing reporters for monitoring DNA repair pathway utilization at endonuclease-induced breaks. Nucleic Acids Res, 2014, 42(1): e4.

(責(zé)任編委: 呂紅)

Development and application of dual-fluorescence reporter systems for measuring specific nuclease activity based on SSA repair mechanism

Furong Han1, Ling Wang1,2, Kun Xu1, Zhiying Zhang1, Xin Wang1
1. College of Animal Science & Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of technology, Hanzhong 723000, China

Reporter vector system has become an important method for measuring activity of specific nucleases because of its fast construction, simple modification, easy operation, economic effectiveness as well as its role in enriching positive cells with genomic modification through mediating screen of specific nucleases positive cells. After introducing double strand breaks (DSBs), a reporter system based on non-homologous end joining (NHEJ)-mediated repair can only repair maximally two thirds of reporter genes after optimization, while single strand annealing (SSA)-mediated repair can repair all reporter genes theoretically which has higher sensitivity and facilitates the detection of specific nuclease with low activity and provides an effective way to detect specific nuclease activity in genome modification studies. In this study, we designed and constructed three sets of dual-fluorescence reporter systems basedon SSA repair mechanism and applied the mRFP-eGFP system in measuring the effective activity of three pairs of ZFNs, which was 8.9%, 9.3% and 5.0%, respectively. Our study provides an effective way to detect the activity of nucleases.

SSA; dual-fluorescence reporter system; specific nucleases

2015-06-01;

2015-09-06

陜西省科技攻關(guān)項目(編號：2014K02-07-01)資助

韓芙蓉，碩士研究生，專業(yè)方向：動物遺傳育種與繁殖。E-mail: hanfr611miffy@sina.com

王昕，博士，教授，研究方向：生物技術(shù)與家畜育種。E-mail: wxwza@126.com

10.16288/j.yczz.15-246

時間:2015-9-11 9:54:26

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150911.0954.004.html