郭亞，吳強上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學教育部重點實驗室，上海 200240

采用DNA片段編輯技術反轉CTCF結合位點改變基因組拓撲結構和增強子與啟動子功能

郭亞，吳強
上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學研究中心，系統(tǒng)生物醫(yī)學教育部重點實驗室，上海 200240

郭亞(博士研究生)

人類的祖先很早就觀察到生物性狀的遺傳現(xiàn)象，但是直到19世紀60年代孟德爾發(fā)現(xiàn)遺傳因子的分離定律和自由組合定律，遺傳學才真正建立并快速發(fā)展起來。盡管人類很快有了基因的概念，并認識了核酸和蛋白質，但直到1953年沃森和克里克闡明了DNA的雙螺旋結構之后，人類對基因才有了本質的認識，從而開啟了分子遺傳學時代。隨著人類基因組計劃測序工作的完成以及最近大規(guī)模測序技術的突破，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)很多遺傳疾病相關位點不僅位于啟動子和基因編碼區(qū)，而且也大量地存在于調控組織發(fā)育基因表達的增強子中。更多的遺傳疾病相關位點則位于功能未知的基因組區(qū)域。近年研究發(fā)現(xiàn)這些遺傳疾病相關位點可能與三維基因組(3D genome)息息相關并通過染色體高級拓撲架構 (Higher-order topological chromosome architecture)起作用。

在細胞分裂間期，人類大約兩米長的30億DNA堿基對在核酸和蛋白質相互作用下高度有機折疊在約5～10 μm的細胞核內，形成復雜的三維基因組。這種三維基因組隨著時間的推移不斷變化形成所謂的四維細胞核組 (4D nucleome)，提供了細胞核發(fā)揮各種生物學功能的物質基礎，包括在生命發(fā)育過程中實現(xiàn)精準的組織和細胞特異性基因表達調控。在細胞核中，不同染色體占據不同的區(qū)域，被稱為“染色體領地” (Chromosome territory)，染色體領地內又包含很多相對穩(wěn)定的染色質拓撲結構域 (Topological chromatin domain)。在染色質拓撲結構域內存在著各種特異性的長距離DNA間相互作用，如增強子、沉默子、絕緣子和啟動子等DNA功能元件之間的相互作用。近年研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物基因組中增強子數(shù)量遠大于啟動子的數(shù)量，并且基因表達可能受到多個啟動子的調控，這種特異性的增強子-啟動子相互作用依賴于特定 DNA元件之間的三維高級空間構象。絕緣子元件在形成特異性DNA間相互作用中扮演著重要的角色，但是其分子機制還不清楚。

人類原鈣粘蛋白 (Protocadherin, Pcdh) 基因座包括Pcdhα、Pcdhβ和Pcdhγ在內的3個基因簇，在腦發(fā)育和腦認知中起到重要作用，原鈣粘蛋白的突變與自閉癥和精神分裂癥等復雜精神疾病相關。除原鈣粘蛋白αc2、β1、γc4和γc5啟動子外的每一個原鈣粘蛋白基因啟動子區(qū)都包括CBS位點。這些啟動子 CBS位點都是正向的；此外增強子區(qū)也包括CBS位點，但增強子CBS位點卻是反向的。CTCF蛋白能夠特異性地介導原鈣粘蛋白α增強子與啟動子之間的長距離染色質環(huán)化，而且CBS位點位于染色質環(huán)的錨定點 (Anchor point) 并相互靠近且呈現(xiàn)相反的方向。原鈣粘蛋白增強子與啟動子特異性染色質環(huán)化可以實現(xiàn)在腦發(fā)育中單個細胞中原鈣粘蛋白啟動子的選擇性激活和原鈣粘蛋白基因的組合表達。這種獨特的CBS位點的方向性可能與其介導的特異性增強子與啟動子環(huán)化相關并在神經發(fā)育中具有重要的基因調控功能。該研究結果于 2012年 12月發(fā)表于Proc Natl Acad Sci USA (DOI:10.1073/pnas. 1219280110)。

本研究團隊通過多種基于染色質構象捕獲技術的方法進一步發(fā)現(xiàn)，原鈣粘蛋白β和γ基因簇具有共同的調控區(qū)域，其調控區(qū)域與原鈣粘蛋白 β和 γ基因的啟動子形成染色質環(huán)化，這些相互重疊的染色質環(huán)具有特定的方向性，形成一個CTCF/Cohesin介導的原鈣粘蛋白 β和 γ染色質拓撲結構域(CTCF/Cohesin-mediated chromatin domain: CCD)；但是原鈣粘蛋白α具有相對獨立的調控區(qū)，其與原鈣粘蛋白α基因形成染色質環(huán)化，這些染色質環(huán)同樣具有方向性并形成原鈣粘蛋白α染色質拓撲結構域。所以原鈣粘蛋白基因簇包含兩個相對獨立的CTCF/Cohesin介導的染色質拓撲結構域 (CCD)，而且原鈣粘蛋白基因簇內CTCF介導的相互作用總是在正向-負向CBS位點之間建立。為闡明這種CBS位點的排列方向與長距離染色質相互作用的關系，本研究團隊在CRISPR技術基礎上利用Cas9核酸酶和一對sgRNA建立了一種高效的原位DNA片段編輯方法，該方法于2015年3月發(fā)表于J Mol Cell Biol (DOI: 10.1093/jmcb/ mjv016)，詳見本期“基因組編輯技術”?？芯C述文章《CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA片段編輯中的應用》對該方法的介紹。

通過原位DNA片段編輯方法，本研究團隊反轉了包含CBS位點增強子并進一步研究發(fā)現(xiàn)增強子反轉后其與上游Pcdhα啟動子的相互作用顯著降低，但產生了與下游Pcdhβ和Pcdhγ啟動子的新的相互作用，也就是說反轉引起染色質高級拓撲架構改變。因此CBS位點的方向性決定了染色質環(huán)化的方向性從而決定了染色質拓撲結構的形成。通過 RNA-seq實驗發(fā)現(xiàn)，增強子反轉造成多個 Pcdhα、Pcdhβ和Pcdhγ基因顯著降低。這些結果表明反轉增強子能夠改變原鈣粘蛋白范圍內的增強子與啟動子間的相互作用，并引起原鈣粘蛋白基因表達的改變。利用計算生物學方法進一步驗證了CBS位點排列方向與其相互作用形成染色質環(huán)化的方向密切相關，即大多數(shù)CTCF和Cohesin介導的染色質相互作用都是在正向-負向CBS位點之間建立的，少量CTCF和Cohesin介導的相互作用是在同向的CBS位點之間建立的。最后，通過 CRISPR技術在 β珠蛋白(β-globin) 基因簇區(qū)域敲除或反轉CBS位點進一步驗證了該規(guī)律的普適性。因此，基因組中至少一部分含有CBS的增強子是以方向依賴性的方式調控其靶向基因，而不是通常認為的增強子調控基因表達不具有方向性。該研究結果揭示了三維DNA結構是如何由一維的DNA序列所“編碼”，因而闡明了DNA遺傳信息在三維基因組結構建立與形成中的重要作用 (圖 1)，對于從三維基因組角度認識各種遺傳性疾病的根本病因以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展機理具有重要意義。該項研究結果于2015年8月發(fā)表于Cell(DOI: 10.1016/j.cell.2015. 07.038)。

圖1 基因組范圍內CTCF結合位點(CBS)的一維DNA序列信息參與決定三維DNA結構