邵仕萍, 相大鵬, 李 雙, 奚星林, 陳文銳

(廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 廣州 510623)

技術(shù)與應(yīng)用

酸水解-氣相色譜法測定奶粉中的二十二碳六烯酸

邵仕萍*, 相大鵬, 李 雙, 奚星林, 陳文銳

(廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 廣東 廣州 510623)

建立了鹽酸水解,索氏提取總脂肪酸,氫氧化鉀甲醇溶液甲酯化,硫酸氫鈉處理,氣相色譜測定奶粉中二十二碳六烯酸(DHA)含量的方法。采用三因素三水平正交試驗對氫氧化鉀甲醇溶液甲酯化條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到最優(yōu)反應(yīng)條件為:1 mol/L氫氧化鉀在25 ℃反應(yīng)5 min。甲酯化衍生液經(jīng)硫酸氫鈉處理,在SP-2560氣相色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)上進(jìn)行55 min程序升溫測定DHA含量。DHA在5.0～300 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。DHA質(zhì)量濃度為10、50、100 mg/L時目標(biāo)峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.4%、1.2%和1.1%。方法檢出限為2 mg/kg,回收率為90.4%～93.5%。該法用于實際樣品的檢測,結(jié)果令人滿意。

氣相色譜;二十二碳六烯酸;奶粉;酸水解

二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid, DHA),俗稱腦黃金,是一種對人體非常重要的多不飽和脂肪酸。嬰幼兒缺乏DHA可能造成發(fā)育遲緩、智力障礙、皮膚異常鱗屑等不良后果[1-5]。嬰幼兒奶粉作為寶寶的主要食物來源,是模擬母乳制作的配方粉,其DHA平均含量為總脂肪酸的0.2%。DHA含有6個雙鍵,易受光、氧、熱、金屬離子的作用而變質(zhì)[6],且具有魚腥味,所以DHA原料供應(yīng)商常用纖維素、蛋白質(zhì)等材料包埋DHA,以滿足人體的營養(yǎng)需要,并解決味覺上的不適應(yīng)。目前,關(guān)于DHA含量檢測技術(shù)的研究主要集中于人體血液中DHA含量的測定[7-10]和食品中DHA含量的測定[11-18],通常是先對DHA進(jìn)行衍生化,然后進(jìn)行色譜檢測。中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.27-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測定》[15]規(guī)定了奶粉中DHA的測定方法,但隨著食品工業(yè)的發(fā)展,DHA包埋技術(shù)不斷更新,國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的DHA檢測方法和先前文獻(xiàn)報道的方法已不能有效地測定各類奶粉中DHA的含量。這就需要發(fā)展新的DHA檢測技術(shù),以適應(yīng)食品工業(yè)的進(jìn)步。本文所建立的方法可以有效地測定各類奶粉中DHA的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A氣相色譜,配7683B自動進(jìn)樣器、氫火焰離子化檢測器(FID)及B04.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(安捷倫公司); SOXTEC 2050索氏提取儀(FOSS公司)。DHA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)、DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)(上海安譜科學(xué)儀器有限公司);電子天平,感量0.1 mg(Sartorius公司);異辛烷(色譜純);鹽酸、氫氧化鉀、甲醇、正己烷、無水硫酸氫鈉(分析純);實驗用水為去離子水;

DHA標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制(1 g/L): 0.1 g DHA標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL異辛烷中;其他各級DHA標(biāo)準(zhǔn)使用液根據(jù)需要逐級稀釋,最大稀釋比不大于1 000∶1; DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制(1 g/L): 0.1 g DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶于100 mL異辛烷中;其他各級DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)使用液根據(jù)需要逐級稀釋,最大稀釋比不大于1 000∶1;氫氧化鉀甲醇溶液(1 mol/L): 5.6 g氫氧化鉀溶于100 mL的甲醇中;氯化鈉溶液:40 g氯化鈉溶于100 mL水中;鹽酸溶液:向50 mL水中加入鹽酸100 mL,搖勻。

1.2 樣品前處理

總脂肪提取:稱取5 g奶粉于100 mL三角燒瓶中,加入50 mL的鹽酸溶液,于100 ℃水浴1 h。過濾,并用少許熱水沖洗燒瓶,用沸水漂洗過濾器及其內(nèi)容物,直到濾液中性。在室溫下過夜(至少12 h),干燥內(nèi)容物。用正己烷索氏提取總脂肪酸,稱重,備用。

甲酯化:稱取0.1 g上述總脂肪酸于試管中,加入2 mL異辛烷,振搖混勻。加入0.2 mL 1.0 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液,立即蓋上蓋子,25 ℃下劇烈振搖5 min,靜置分層,加入2 mL氯化鈉溶液短暫振搖。將異辛烷層轉(zhuǎn)移到樣品管,加入1 g硫酸氫鈉并且振搖樣品管,靜置分層后取異辛烷層過0.45 μm濾膜后用于上機(jī)測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Supelco SP-2560氣相色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm);升溫程序:140 ℃保持5 min,以4 ℃/min升至240 ℃,保持25 min;載氣(N2)流速0.80 mL/min,壓力212.2 kPa,進(jìn)樣量0.5 μL;分流比:20∶1;進(jìn)樣口溫度:250 ℃; FID溫度:260 ℃。

1.4 結(jié)果計算

DHA的測定結(jié)果采用外標(biāo)法計算,結(jié)合提取液的體積以及總脂肪酸的質(zhì)量求得DHA在總脂肪酸中的含量。結(jié)合奶粉中總脂肪酸的測定結(jié)果,求得相應(yīng)奶粉中DHA的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)峰位置的確定

DHA標(biāo)準(zhǔn)品按照1.2節(jié)所述的操作進(jìn)行甲酯化,再按照1.3節(jié)所述的條件進(jìn)行色譜檢測,所得色譜圖中出現(xiàn)多個色譜峰,不易確定DHA甲酯所對應(yīng)的目標(biāo)峰,因此用DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜檢測確定目標(biāo)峰。取50 mg/L的DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3節(jié)所述的條件進(jìn)行色譜檢測,所得色譜圖簡潔明了,DHA甲酯所對應(yīng)的目標(biāo)峰的保留時間為50.350 min,如圖1所示。

圖1 (a)DHA標(biāo)準(zhǔn)品和(b)奶粉樣品的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatograms of (a) DHA standard and (b) a milk powder sample containing DHA

2.2 總脂肪酸的提取條件

奶粉中總脂肪酸的提取通常是先將奶粉樣品進(jìn)行水解,然后以正己烷為提取劑進(jìn)行索氏抽提。因所用試劑的不同,水解方式分為堿水解和酸水解兩種[12,17,19,20]。考慮到奶粉進(jìn)入人體要被胃液消化,然后再被吸收,本方法模擬胃液使用鹽酸溶液對奶粉樣品進(jìn)行酸水解,然后索氏提取總脂肪酸。

2.3 DHA甲酯化條件的優(yōu)化

甲酯化是DHA檢測的關(guān)鍵步驟,通常使用氫氧化鉀(或氫氧化鈉)甲醇溶液作為甲酯化試劑在指定的時間和溫度下完成。雖然相同原理的甲酯化在多篇文獻(xiàn)[11,14-16,21]中均有提及,但具體條件有顯著差異。為了獲得DHA甲酯化的最佳反應(yīng)條件,設(shè)計了三因素三水平L9(33)正交實驗,對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及甲酯化試劑KOH濃度進(jìn)行優(yōu)化。任意選取了某一嬰兒奶粉的總脂肪酸提取物作為實驗樣品,相關(guān)因素的考察水平來源于GB/T 5009.168-2003[11]、GB 5413.27-2010[15]和ES ISO 12966-2:2012[21]。實驗條件及結(jié)果見表1和表2。

表1 正交實驗的因素和水平

表2 實驗條件的選擇L9(33)正交表

-: blank.

由表2可知,反應(yīng)溫度是甲酯化反應(yīng)的主要影響因素,且溫度較低時效果更好,主要是因為DHA中含有6個雙鍵,高溫時易變質(zhì);反應(yīng)時間不宜過長,否則也會因為DHA變質(zhì)而致使效率降低;KOH濃度對反應(yīng)影響相對較小。根據(jù)主要從優(yōu),兼顧成本效率的原則,確定A1B2C2為最佳試驗條件,即2#試驗所對應(yīng)的條件,具體為1 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液在25 ℃反應(yīng)5 min。使用最佳試驗條件進(jìn)行5次驗證性試驗,其結(jié)果(DHA在總脂肪酸中的含量)為0.270%、0.273%、0.274%、0.271%和0.273%,與2#試驗結(jié)果相近,最佳試驗條件可靠。

2.4 線性范圍與檢出限

取DHA標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋成500、400、300、200、100、80、60、40、20、10、5.0、2.0、1.0 mg/L的系列DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2節(jié)所述的操作進(jìn)行甲酯化,再按照1.3節(jié)所述的條件進(jìn)行色譜檢測,以DHA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, mg/L),以目標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制工作曲線。結(jié)果表明DHA質(zhì)量濃度在5.0～300 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性方程為Y=0.349 4X+0.821 0,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。儀器檢出限為1 mg/L (S/N=3),奶粉中DHA的檢出限為:0.2 mg/100 g。

2.5 精密度與回收率

取10、50、100 mg/L的DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL各7份,按建立的方法進(jìn)行甲酯化和色譜檢測,考察方法的精密度,得到對應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.4%、1.2%和1.1%,表明本法具有良好的重復(fù)性。取嬰兒奶粉、較大嬰兒奶粉和幼兒奶粉樣品各一種,分別進(jìn)行7次測定,得出DHA平均含量分別為:50.4、40.7和8.2 mg/100 g,用上述3種奶粉樣品作基體進(jìn)行加標(biāo)回收試驗,結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

表3 (續(xù))

由表3可知3種奶粉樣品的加標(biāo)回收率為90.4%～93.5%,且對應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～3.3%范圍內(nèi),說明本方法準(zhǔn)確度高。

2.6 實際樣品測定

用國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5413.27-2010[15](第一法乙酰氯-甲醇甲酯化法)和本方法分別對18個奶粉樣品進(jìn)行DHA含量的測定,結(jié)果如表4所示。由表4可知本方法的測定結(jié)果與樣品的標(biāo)簽值十分接近,而國標(biāo)方法的測定結(jié)果往往與樣品的標(biāo)簽值有較大差異,甚至?xí)霈F(xiàn)無法檢出的現(xiàn)象。

表4 奶粉中DHA的測定結(jié)果

N.D.: not detected; -: blank.

3 結(jié)論

本文建立的酸水解-氣相色譜測定奶粉中二十二碳六烯酸含量的方法國內(nèi)外未見相關(guān)報道,用酸水解代替堿水解提取脂肪,一方面能破解包埋材料,另一方面模擬人體胃液環(huán)境,更為科學(xué)實用。對于各類實際奶粉樣品中DHA含量的測定結(jié)果表明本方法明顯優(yōu)于國標(biāo)方法。另外,方法中用到的無水硫酸氫鈉不能用其他試劑(如無水硫酸鈉)替代,具體原理有待進(jìn)一步研究。

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《色譜》論文中可直接使用的縮略詞

《色譜》多位編委獲得2015年中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎

《色譜》副主編江桂斌,責(zé)任副主編劉虎威,編委汪海林、林金明、梁鑫淼、李彤獲得2015年“中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎”。該獎簡稱“CAIA獎”,經(jīng)國家科學(xué)技術(shù)獎勵工作辦公室批準(zhǔn),由中國分析測試協(xié)會設(shè)立,旨在獎勵分析測試領(lǐng)域新方法、新技術(shù)、新應(yīng)用研究中取得優(yōu)秀成果的科技工作者和組織,促進(jìn)我國分析測試技術(shù)水平的不斷提高。根據(jù)《中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎(CAIA獎)評獎細(xì)則》,特等獎獎勵具有國際領(lǐng)先水平或特大社會經(jīng)濟(jì)效益的重大成果;一等獎獎勵具有國際水平或顯著社會經(jīng)濟(jì)效益的成果;二等獎獎勵具有國內(nèi)領(lǐng)先水平或具有較好社會經(jīng)濟(jì)效益的成果;三等獎獎勵具有國內(nèi)先進(jìn)水平或應(yīng)用中有顯著效果的成果;青年獎獎勵在基礎(chǔ)研究或應(yīng)用推廣中具有較顯著成效的成果。

本屆評獎范圍針對于2013年1月1日到2015年7月間取得的、在分析測試新技術(shù)、新方法和新應(yīng)用方面的創(chuàng)新性成果。本屆共收到申請項目73項,內(nèi)容涉及面廣泛,有農(nóng)產(chǎn)品與食品安全、生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)、能源與環(huán)境、儀器新技術(shù)及其應(yīng)用等多個重點學(xué)科和熱點領(lǐng)域。按照《中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎(CAIA獎)評獎細(xì)則》,中國分析測試協(xié)會聘請有關(guān)方面的專家、學(xué)者組成評審委員會,從創(chuàng)新程度、科學(xué)價值、主要論文發(fā)表刊物或著作的影響力、應(yīng)用推廣程度、已獲經(jīng)濟(jì)或社會效益等五方面對申報項目進(jìn)行評審。經(jīng)過形式審查、函評、初評和終評,完成了2015年“中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎(CAIA獎)”評審工作,共評出特等獎2項,一等獎8項,二等獎12項,三等獎12項,青年獎6項。

Determination of docosahexaenoic acid in milk powder by gas chromatography using acid hydrolysis

SHAO Shiping*, XIANG Dapeng, LI Shuang, XI Xinglin, CHEN Wenrui

(InspectionandQuarantineTechnologyCentre,GuangdongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510623,China)

A method to determine docosahexenoic acid (DHA) in milk powder by gas chromatography was established. The milk powder samples were hydrolyzed with hydrochloric acid, extracted to get total fatty acids by Soxhlet extractor, then esterified with potassium hydroxide methanol solution to form methyl esters, and treated with sodium hydrogen sulfate. The optimal experiment conditions were obtained from orthogonal experiment L9(33) which performed with three factors and three levels, and it requires the reaction performed with 1 mol/L potassium hydroxide solution at 25 ℃ for 5 min. The derivative treated with sodium hydrogen sulfate was separated on a column of SP-2560 (100 m×0.25mm×0.20 μm), and determined in 55 min by temperature programming-gas chromatography. Good linearity was obtained in the range 5.0-300 mg/L with the correlation coefficient of 0.999 9. The relative standard deviations (RSDs) were 3.4%, 1.2% and 1.1% for the seven repeated experiments of 10, 50 and 100 mg/L of DHA, respectively. The limit of detection was 2 mg/kg, and the recoveries of DHA were in the range of 90.4%-93.5%. The results are satisfactory through the tests of practical samples.

gas chromatography (GC); docosahexenoic acid (DHA); milk powder; acid hydrolysis

2015年中國分析測試協(xié)會科學(xué)技術(shù)獎獲獎?wù)呙麊?/p>

續(xù)

10.3724/SP.J.1123.2015.06022

廣東省廣州市科技計劃項目(12S496140081).

2015-06-17

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1214-05

*通訊聯(lián)系人.Tel:(020)38290331,E-mail:shipingshao@163.com.