馮江+俞加正+鄭潔懷+陳華忠

[摘要] 目的 研究慢性乙肝（CHB）患者阿德福韋酯治療前后及HBV攜帶者CD8+T細(xì)胞表面活化分子CD38和HLA-DR表達(dá)情況，并探討其與疾病進(jìn)展的關(guān)系。 方法 收集32例經(jīng)阿德福韋酯治療的CHB患者，31例HBV攜帶者和28例正常對(duì)照，采集CHB患者治療前后及HBV攜帶者和正常對(duì)照外周血。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量和比例，以及CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+T細(xì)胞比例，HBV DNA和生化由本院檢驗(yàn)室檢測(cè)。 結(jié)果 CHB患者治療前CD8+CD38+T細(xì)胞比例顯著高于HBV攜帶者和正常對(duì)照組，阿德福韋酯治療后顯著降低（P<0.05）。HBV攜帶者CD8+CD38+T細(xì)胞比例高于正常對(duì)照組（P<0.05）。CHB患者治療前CD8+HLA-DR+T細(xì)胞比例顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），但與HBV攜帶者無(wú)明顯差異，阿德福韋酯治療后顯著下降，仍高于正常水平（P<0.05）。 結(jié)論 HBV感染可以引起CD8+T活化水平顯著升高，阿德福韋酯抗病毒治療能夠降低CD8+T的活化。CD8+T活化水平是良好的HBV感染病情評(píng)價(jià)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] HBV；慢性乙肝；免疫活化；CD38；HLA-DR

[中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）34-0014-04

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種非細(xì)胞致病性病毒，HBV感染的臨床結(jié)果主要依賴于宿主的免疫應(yīng)答情況。研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)HBV感染的進(jìn)展十分重要[1]，其中CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)控制病毒的復(fù)制起主要作用[2]。缺乏高強(qiáng)度的、特異性的免疫應(yīng)答是導(dǎo)致慢性乙肝（chronic hepatitis B，CHB）病毒清除失敗和疾病進(jìn)展的主要原因[3，4]。研究外周血T細(xì)胞免疫活化狀態(tài)對(duì)揭示CHB發(fā)病機(jī)制具有重要意義，尤其是CD8+T細(xì)胞的免疫活化。CD38分子是一種表達(dá)在早期T細(xì)胞表面的糖蛋白，成熟以后消失，但是T細(xì)胞活化后又重新出現(xiàn)[5]。作為T細(xì)胞免疫活化的標(biāo)志，CD38在許多急性或慢性感染中均會(huì)表達(dá)升高，如人類免疫缺陷病毒（HIV）、EB病毒（EBV）等感染[5，6]。另外一個(gè)T細(xì)胞免疫活化的指標(biāo)是人類白細(xì)胞抗原-DR（HLA-DR），在HIV的感染中可作為預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的指標(biāo)之一[7]。到目前為止，對(duì)HBV感染者及CHB患者T細(xì)胞免疫活化的研究較少。本文對(duì)慢性乙肝患者阿德福韋酯治療前后及HBV攜帶者CD8+T細(xì)胞表面活化分子CD38和HLA-DR表達(dá)情況進(jìn)行研究，并探討其與病毒復(fù)制和疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取我院2010年6月～2011年6月接受阿德福韋酯抗病毒治療的CHB者32例，其中男20例，女12例，平均年齡（50.2±22.4），平均病程（6.5±5.7）年。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年西安全國(guó)第10屆病毒性肝炎會(huì)議所修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并排除其他病毒性肝炎、酒精、藥物引起的肝損傷等。入組后接受阿德福韋酯10 mg/d 治療12個(gè)月以上。另外，選取HBs抗原陽(yáng)性的乙肝攜帶者31例，其中男22例，女9例，平均年齡（44.8±26.9）歲。以本院門診體檢者32人（均無(wú)特殊病史，體檢無(wú)異常發(fā)現(xiàn)，anti-HBsAg（-），近2個(gè)月無(wú)感染史）作為正常對(duì)照組，男18例，女10例，平均年齡（42.1±20.6）歲。

1.2 樣本的采集

采集慢性乙肝患者治療前及治療12個(gè)月后的外周血2 mL/人，以及HBV攜帶者和正常對(duì)照組血樣2 mL/人，無(wú)菌EDTA抗凝管收集做流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，另外采集血樣分別送化驗(yàn)室進(jìn)行生化及HBVDNA等檢測(cè)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

熒光標(biāo)記的單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)采用BD公司的細(xì)胞計(jì)數(shù)管，其余細(xì)胞比例檢測(cè)采用普通流式管。每管加入50 μl血樣及相應(yīng)抗體，抗體組合如下：CD3-PE/CD4-FITC，CD3-PE/CD8-FITC，CD3-PE/CD8-FITC/CD38-APC，CD3-PE/CD8-FITC/HLA-DR-APC。標(biāo)記好的血樣室溫避光孵育15 min，裂解紅細(xì)胞后，采用BD公司FACScan四色流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

檢測(cè)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 15.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA（SNK法），相關(guān)性分析Persons檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者、HBV攜帶者及對(duì)照組生化和免疫學(xué)比較

CHB患者平均治療時(shí)間為（18.8±5.7）個(gè)月，治療前后相比ALT、TBIL和HBV DNA均有顯著下降（P<0.05），CD4+T細(xì)胞數(shù)量有所上升，CD8+T細(xì)胞數(shù)量下降（P均>0.05），但仍顯著低于正常水平（P<0.01），CD4+T細(xì)胞比例改變不明顯，CD8+T細(xì)胞比例治療前顯著高于正常對(duì)照組，治療后與治療前比顯著下降（P<0.05）。HBV攜帶者HBV DNA顯著高于CHB治療前，CD4+T細(xì)胞數(shù)量和比例均高于CHB患者治療前水平，但CD4+T細(xì)胞數(shù)量低于正常水平（P均<0.05），CD8+T細(xì)胞水平與其余組比較無(wú)顯著差異。見表1。

2.2 各組CD8+T細(xì)胞免疫活化情況比較

CHB患者治療前CD8+CD38+T細(xì)胞比例顯著高于HBV攜帶者和正常對(duì)照組，阿德福韋酯治療后顯著降低，低于HBV攜帶者水平，但仍稍高于正常水平，HBV攜帶者CD8+CD38+T細(xì)胞比例高于正常對(duì)照組。以上P均<0.05，見圖1A。

各組CD8+HLA-DR+T細(xì)胞比例均低于CD8+CD38+T細(xì)胞比例，CHB患者治療前CD8+HLA-DR+T細(xì)胞比例顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），但與HBV攜帶者無(wú)明顯差異，阿德福韋酯治療后顯著下降，仍高于正常水平（P<0.05）。見圖1B。

2.3 CD8+T細(xì)胞免疫活化與病毒學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

CD8+CD38+%和CD8+HLA-DR+%與HBV感染的病情指標(biāo)均表現(xiàn)出良好地相關(guān)性。具體為CD8+CD38+%和CD8+HLA-DR+%與HBV DNA 和ALT水平呈正相關(guān)（P<0.05），與CD8+T細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與CD4+T細(xì)胞數(shù)也呈負(fù)相關(guān)，但P>0.05。見表2。

3 討論

除了HBV DNA和肝功能外，T細(xì)胞的活化狀態(tài)也是評(píng)價(jià)HBV感染的重要指標(biāo)，但是目前這方面的研究報(bào)道不多。既往的研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者與正常人群及HBV攜帶者相比，外周血T細(xì)胞亞群存在比例失衡，體現(xiàn)在CD8+T細(xì)胞比例增高、CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+的下降[8，9]，這與我們的研究相符。在我們的研究中HBV感染能夠引起CD8+T細(xì)胞的顯著活化，并且CHB患者的活化程度高于HBV攜帶者，說明CD8+T細(xì)胞的活化參與了CHB的發(fā)病過程。許多研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞在病毒的清除和疾病的進(jìn)展方面起有重要作用，CD8+T細(xì)胞的活化反映了CD8+T細(xì)胞清除病毒的能力[10，11]。但另一方面，CD8+T細(xì)胞的過度活化又會(huì)引起機(jī)體的免疫損傷，造成疾病進(jìn)展。我們的研究發(fā)現(xiàn)，CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+T細(xì)胞的比例與CD4+和CDC8+T細(xì)胞的數(shù)量呈反比，說明CD8+T細(xì)胞免疫活化可能是造成CHB患者和HBV攜帶者CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量下降的重要原因。Cao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在CHB患者中存在持續(xù)的慢性免疫活化，但不如在HIV和EBV感染中的強(qiáng)烈，這可能與HBV感染主要局限于肝臟有關(guān)。大量激活的T細(xì)胞，包括CD4+T細(xì)胞核CD8+T細(xì)胞，最終大部分會(huì)凋亡，只有少數(shù)會(huì)轉(zhuǎn)化為靜息型的記憶細(xì)胞存活下來。長(zhǎng)期慢性的過度免疫活化導(dǎo)致HBV感染者CD4+和CD8+T細(xì)胞大量消耗，最后導(dǎo)致免疫功能下降，不能抑制病毒的復(fù)制，進(jìn)展到慢性肝病期[13]。

CD38和HLA-DR分子做為T細(xì)胞免疫活化的標(biāo)志，與許多病原體感染有關(guān)[5，6]。有研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染中，CD8+CD38+和CD8+HLA-DR+反映的免疫活化水平與HIV疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，CD4+T細(xì)胞的缺失與免疫活化水平有直接關(guān)系，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+百分比比病毒載量更能反映機(jī)體的免疫活化情況[14，15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染中，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+百分比與HBV DNA和ALT呈正相關(guān)，這與Cao等的研究結(jié)果一致。我們的研究結(jié)果提示，CD8+T細(xì)胞的活化程度與HBV造成炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)，是引起肝臟炎癥損傷的重要原因之一。因此，免疫活化指標(biāo)，尤其是CD8+T細(xì)胞上CD38和HLA-DR分子的表達(dá)是評(píng)價(jià)HBV感染者病情的良好指標(biāo)。

此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，阿德福韋酯抗病毒治療不僅可以抑制CHB患者體內(nèi)HBV的復(fù)制，使病毒載量顯著下降，而且使免疫活化水平顯著下降，接近正常水平，但仍然偏高。這一結(jié)果表明，CD8+T細(xì)胞的免疫活化的直接原因可能是HBV的大量復(fù)制，CD8+T細(xì)胞免疫活化程度與HBV DNA拷貝數(shù)的正相關(guān)也證明了這一點(diǎn)。另外，在HIV-1感染中的研究發(fā)現(xiàn)，接受高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的艾滋病患者，即使HIV復(fù)制被完全抑制，病毒載量下降到檢測(cè)不到的水平，CD8+CD38+和CD8+ HLA-DR+T細(xì)胞的比例仍然高于正常水平，這可能是因?yàn)殡m然病毒復(fù)制水平被抑制到檢測(cè)限以下，但仍然有少量的病毒持續(xù)存在，使T細(xì)胞的免疫活化維持在較高水平[16]。對(duì)接受阿德福韋酯治療的CHB患者的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞的免疫活化在治療開始的12周內(nèi)就開始下降，并隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生迅速、持續(xù)地降低，并有許多患者恢復(fù)到正常水平[12]。這些研究進(jìn)一步證明，病毒顆粒本身是導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞免疫活化的直接原因。因此，及時(shí)的、持續(xù)的抗病毒治療，最大限度地降低病毒載量，是減少HBV感染者CD8+T細(xì)胞免疫活化的重要治療措施。

綜上，我們的研究表明，HBV感染可以導(dǎo)致機(jī)體CD8+T細(xì)胞的免疫活化，并且這種免疫活化與HBV感染病情進(jìn)展有關(guān)，并可能參與了CHB的發(fā)病過程。阿德福韋酯不僅可以抑制HBV的復(fù)制，降低病毒載量，還可以通過降低CD8+T細(xì)胞的免疫活化，進(jìn)而改善CHB患者的免疫狀況，減少炎癥損傷和T細(xì)胞的消耗。進(jìn)一步的研究需要對(duì)接受抗病毒治療CHB患者進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Baumert TF，Thimme R，von WF. Pathogenesis of hepatitis B virus infection[J]. World J Gastroenterol，2007，13（1）：82-90.

[2] Maini MK，Boni C，Ogg GS，et al. Direct ex vivo analysis of hepatitis B virus-specific CD8（+） T cells associated with the control of infection[J]. Gastroenterology，1999， 117（6）：1386-1396.

[3] Bertoletti A，Gehring AJ. The immune response during hepatitis B virus infection[J]. J Gen Virol，2006，87（Pt 6）：1439-1449.

[4] Maini MK，Boni C，Lee CK，et al. The role of virus-specific CD8（+） cells in liver damage and viral control during persistent hepatitis B virus infection[J]. J Exp Med，2000，191（8）：1269-1280.

[5] Savarino A，Bottarel F，Malavasi F，et al. Role of CD38 in HIV-1 infection：An epiphenomenon of T-cell activation or an active player in virus/host interactions[J]. AIDS，2000， 14（9）：1079-1089.

[6] Zidovec LS，Vince A，Dakovic RO，et al. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection[J]. Clin Exp Immunol，2003，133（3）：384-390.

[7] Gascon RL，Narvaez AB，Zhang R，et al. Increased HLA-DR expression on peripheral blood monocytes in subsets of subjects with primary HIV infection is associated with elevated CD4 T-cell apoptosis and CD4 T-cell depletion[J].J Acquir Immune Defic Syndr， 2002，30（2）：146-153.

[8] Tsai SL，Chen PJ，Lai MY，et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion[J]. J Clin Invest，1992，89（1）：87-96.

[9] Rehermann B，Lau D，Hoofnagle JH，et al. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Clin Invest，1996，97（7）：1655-1665.

[10] Bofill M，Borthwick NJ. CD38 in health and disease[J]. Chem Immunol，2000，（75）：218-234.

[11] Tilling R，Kinloch S，Goh LE，et al. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection[J]. AIDS，2002，16（4）：589-596.

[12] Cao W，Qiu ZF，Li TS. Parallel decline of CD8+CD38+ lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients[J].World J Gastroenterol，2011，17（17）：2191-2198.

[13] 賈繼東. 2010年《慢性乙型肝炎防治指南》更新要點(diǎn)[J].胃腸病學(xué)，2011，16（6）：321-322.

[14] Sousa AE，Carneiro J，Meier-Schellersheim M，et al. CD4 T cell depletion is linked directly to immune activation in the pathogenesis of HIV-1 and HIV-2 but only indirectly to the viral load[J]. J Immunol，2002，169（6）：3400-3406.

[15] Resino S，Seoane E，Gutierrez MD，et al. CD4（+） T-cell immunodeficiency is more dependent on immune activation than viral load in HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2006，42（3）：269-276.

[16] Rosso R，F(xiàn)enoglio D，Terranova MP，et al. Relevance of CD38 expression on CD8 T cells to evaluate antiretroviral therapy response in HIV-1-infected youths[J]. Scand J Immunol， 2010，71（1）：45-51.

（收稿日期：2014-05-28）

[5] Savarino A，Bottarel F，Malavasi F，et al. Role of CD38 in HIV-1 infection：An epiphenomenon of T-cell activation or an active player in virus/host interactions[J]. AIDS，2000， 14（9）：1079-1089.

[6] Zidovec LS，Vince A，Dakovic RO，et al. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection[J]. Clin Exp Immunol，2003，133（3）：384-390.

[7] Gascon RL，Narvaez AB，Zhang R，et al. Increased HLA-DR expression on peripheral blood monocytes in subsets of subjects with primary HIV infection is associated with elevated CD4 T-cell apoptosis and CD4 T-cell depletion[J].J Acquir Immune Defic Syndr， 2002，30（2）：146-153.

[8] Tsai SL，Chen PJ，Lai MY，et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion[J]. J Clin Invest，1992，89（1）：87-96.

[9] Rehermann B，Lau D，Hoofnagle JH，et al. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Clin Invest，1996，97（7）：1655-1665.

[10] Bofill M，Borthwick NJ. CD38 in health and disease[J]. Chem Immunol，2000，（75）：218-234.

[11] Tilling R，Kinloch S，Goh LE，et al. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection[J]. AIDS，2002，16（4）：589-596.

[12] Cao W，Qiu ZF，Li TS. Parallel decline of CD8+CD38+ lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients[J].World J Gastroenterol，2011，17（17）：2191-2198.

[13] 賈繼東. 2010年《慢性乙型肝炎防治指南》更新要點(diǎn)[J].胃腸病學(xué)，2011，16（6）：321-322.

[14] Sousa AE，Carneiro J，Meier-Schellersheim M，et al. CD4 T cell depletion is linked directly to immune activation in the pathogenesis of HIV-1 and HIV-2 but only indirectly to the viral load[J]. J Immunol，2002，169（6）：3400-3406.

[15] Resino S，Seoane E，Gutierrez MD，et al. CD4（+） T-cell immunodeficiency is more dependent on immune activation than viral load in HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2006，42（3）：269-276.

[16] Rosso R，F(xiàn)enoglio D，Terranova MP，et al. Relevance of CD38 expression on CD8 T cells to evaluate antiretroviral therapy response in HIV-1-infected youths[J]. Scand J Immunol， 2010，71（1）：45-51.

（收稿日期：2014-05-28）

[5] Savarino A，Bottarel F，Malavasi F，et al. Role of CD38 in HIV-1 infection：An epiphenomenon of T-cell activation or an active player in virus/host interactions[J]. AIDS，2000， 14（9）：1079-1089.

[6] Zidovec LS，Vince A，Dakovic RO，et al. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection[J]. Clin Exp Immunol，2003，133（3）：384-390.

[7] Gascon RL，Narvaez AB，Zhang R，et al. Increased HLA-DR expression on peripheral blood monocytes in subsets of subjects with primary HIV infection is associated with elevated CD4 T-cell apoptosis and CD4 T-cell depletion[J].J Acquir Immune Defic Syndr， 2002，30（2）：146-153.

[8] Tsai SL，Chen PJ，Lai MY，et al. Acute exacerbations of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens. Implications for hepatitis B e antigen seroconversion[J]. J Clin Invest，1992，89（1）：87-96.

[9] Rehermann B，Lau D，Hoofnagle JH，et al. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Clin Invest，1996，97（7）：1655-1665.

[10] Bofill M，Borthwick NJ. CD38 in health and disease[J]. Chem Immunol，2000，（75）：218-234.

[11] Tilling R，Kinloch S，Goh LE，et al. Parallel decline of CD8+/CD38++ T cells and viraemia in response to quadruple highly active antiretroviral therapy in primary HIV infection[J]. AIDS，2002，16（4）：589-596.

[12] Cao W，Qiu ZF，Li TS. Parallel decline of CD8+CD38+ lymphocytes and viremia in treated hepatitis B patients[J].World J Gastroenterol，2011，17（17）：2191-2198.

[13] 賈繼東. 2010年《慢性乙型肝炎防治指南》更新要點(diǎn)[J].胃腸病學(xué)，2011，16（6）：321-322.

[14] Sousa AE，Carneiro J，Meier-Schellersheim M，et al. CD4 T cell depletion is linked directly to immune activation in the pathogenesis of HIV-1 and HIV-2 but only indirectly to the viral load[J]. J Immunol，2002，169（6）：3400-3406.

[15] Resino S，Seoane E，Gutierrez MD，et al. CD4（+） T-cell immunodeficiency is more dependent on immune activation than viral load in HIV-infected children on highly active antiretroviral therapy[J]. J Acquir Immune Defic Syndr，2006，42（3）：269-276.

[16] Rosso R，F(xiàn)enoglio D，Terranova MP，et al. Relevance of CD38 expression on CD8 T cells to evaluate antiretroviral therapy response in HIV-1-infected youths[J]. Scand J Immunol， 2010，71（1）：45-51.

（收稿日期：2014-05-28）