羅敏 李帥軍 胡響當(dāng) 王曉艷 林仁敬 楊周雨

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南長沙410005

芍藥湯對胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜核因子-κB DNA結(jié)合活性的影響

羅敏 李帥軍 胡響當(dāng) 王曉艷 林仁敬 楊周雨

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科，湖南長沙410005

目的研究芍藥湯對胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠核因子-κB（NF-κB）DNA結(jié)合活性的影響。方法將40只SD大鼠隨機分為4組：正常組，模型組，芍藥湯組，柳氮磺胺吡啶（SASP）組。制備胃腸濕熱型模型，然后采用三硝基苯磺酸（TNBS）制備灌腸法潰瘍性結(jié)腸炎模型，灌胃治療10 d后處死大鼠，取新鮮結(jié)腸黏膜標本提取核蛋白，利用以酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）為基礎(chǔ)的Trans AMTMNF-κB P65試劑盒檢測各組NF-κB相對活性。結(jié)果與正常組比較［（0.263±0.041）］，模型組大鼠NF-κB相對活性明顯增高［（0.467±0.083）］，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB相對活性明顯降低［（0.271±0.089）］，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)。結(jié)論芍藥湯能明顯降低胃腸濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型結(jié)腸黏膜NF-κB相對活性，可能是其治潰瘍性結(jié)腸炎作用的機制之一。

芍藥湯；胃腸濕熱；潰瘍性結(jié)腸炎；核因子-κB

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的病因和發(fā)病機制迄今尚未明確，其中免疫因素在此病中所起的作用越來越受重視，研究已深入到細胞分子水平，特別是近年來研究發(fā)現(xiàn)核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）調(diào)控著UC患者中細胞因子和細胞黏附分子（cell adhesionmolecules，CAM）的釋放，從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)。芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》，具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效，根據(jù)多年的臨床研究，對于胃腸濕熱型UC，具有良好的療效，為求進一步明確芍藥湯干預(yù)UC調(diào)節(jié)作用機制，本實驗通過檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，從基因水平探討芍藥湯干預(yù)UC的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠40只，體重180～220 g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室［合格證號：SCXK（湘）2011～0003］，動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗器材

核蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物公司）；BCA-100蛋白質(zhì)定量測定試劑盒（西安晶彩生物科技有限公司）；Tarns AMTMNF-κB酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海齊一生物物技有限公司）；ZFMQ050PE型超純水器（上海摩勒科學(xué)儀器有限公司）；3K-30Z型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）。

1.3 實驗陽性對照藥物與試劑

柳氮磺胺吡啶（SASP）（上海福達制藥有限公司，批號：201310001，每片0.25 g），三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma公司），藥物用蒸餾水配成50 g/L。

1.4 實驗用藥的制備

芍藥湯超微顆粒由芍藥、當(dāng)歸、黃連、檳榔、木香、黃芩、大黃、肉桂、甘草9味藥組成。組方超微顆粒由湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司提供，然后在湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑科，將藥物用蒸餾水制成含生藥1.32 g/mL水劑。

1.5 實驗方法

1.5.1 造模及分組將40只大鼠隨機分為4組，每組各10只，正常組、模型組、芍藥湯組、SASP組。除正常組外，其余3組首先參考文獻［1-2］復(fù)制胃腸濕熱模型：以高脂高糖飲食飼養(yǎng)大鼠，即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加用200 g/L蜂蜜水自由飲用，每隔1 d按大鼠體重灌服油脂10 g/kg，并與油脂一起灌服10 mL/kg白酒，共10 d。然后再放入溫度（32±2）℃，相對濕度為95%的人工氣候箱中，共5 d。待胃腸濕熱型模型造模成功后，再予以TNBS灌腸法制作UC大鼠模型。造UC模型前予禁食24 h，除正常組，其余各組大鼠先用乙醚麻醉，然后從肛門將大鼠灌胃針頭輕輕插入，避免損傷腸道，深度約為8 cm，推入TNBS溶液（含25 mL/L TNBS和500 mL/L乙醇）4 mL/kg體重，捏緊肛門平放5 min即可，術(shù)后予以常規(guī)飼養(yǎng)。待造模4 d后，隨機從每組中抽出1只處死并解剖，游離其結(jié)腸組織，用生理鹽水洗凈后，觀察距肛門7～8 cm處見肉眼可辨潰瘍面，病理檢查發(fā)現(xiàn)充血、水腫、隱窩膿腫和典型的潰瘍等形成，確定造模成功。

1.5.2 給藥方法與標本留取確定造模成功后第2天，將大鼠按體表面積折算成成人等效劑量給藥，芍藥湯組折算后為含生藥13.2 g/（kg·d），同理，SASP組折算后為0.5 g/（kg·d）。正常組和模型組大鼠用等體積量生理鹽水經(jīng)胃灌入。每組同時開始按上述劑量給藥，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥24 h后，以脫頸椎法將大鼠處死，提取距肛門8 cm結(jié)腸組織，并沿縱軸剪開，在結(jié)腸病變最明顯處取0.5 cm結(jié)腸，以10%甲醛液固定、石蠟包埋，制成病理切片，HE染色后光鏡下查看；余下部分刮取結(jié)腸黏膜組織，每只大鼠刮取50 mg新鮮結(jié)腸黏膜，立即提取核蛋白。利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AMTMNF-κB P65試劑盒檢測各組NF-κB相對活性。

1.6 觀察指標

①觀察大鼠的體重、大便、食欲、活動度、精神狀態(tài)等；②結(jié)腸大體病理及組織學(xué)改變:觀察大鼠結(jié)腸黏膜的色澤、潰瘍、糜爛、等情況，觀察黏膜有無水腫、糜爛、潰瘍、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞浸潤等改變；③利用以ELISA為基礎(chǔ)的Trans AMTMNF-κB P65試劑盒檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

正常組大鼠體重、大便、飲食、活動均正常。其余3組大鼠在造模后3 d內(nèi)均逐漸出現(xiàn)蜷縮、倦怠懶動、反應(yīng)遲鈍、拱背、便軟、便溏等癥狀，有的黏液便甚至可見肉眼血便。造模第4天每組隨機抽出一只處死后取結(jié)腸，除正常組外剩下各組結(jié)腸組織肉眼可見潰瘍面。芍藥湯組和陽性對照組在用藥4 d以后，上述情況開始逐漸改善，進食量明顯增加，伴隨體重增加明顯，到用藥后期時，大便多呈顆粒狀，黏液便、血便等基本消失。模型組后期血便等癥狀有所改善，但大便仍不成形并大便臭穢。

2.2 結(jié)腸大體病理及組織學(xué)改變

正常組大鼠腸黏膜上皮細胞排列整齊，腺體結(jié)構(gòu)規(guī)則，各層次構(gòu)造清楚，沒有發(fā)現(xiàn)炎癥細胞及潰瘍（圖1 a，封三）。其余組所取結(jié)腸組織可見黏膜充血、水腫、糜爛、潰瘍，有的出現(xiàn)瘢痕形成，部分結(jié)腸擴張、黏膜皺襞變淺，以模型組最為嚴重（圖1 b，封三）。SASP組和芍藥湯組病變明顯減輕，可見充血、水腫、糜爛和紅色瘢痕（圖1 c～d，封三）。

2.3 NF-κB活性

與正常組比較，模型組大鼠NF-κB相對活性明顯增高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥湯組大鼠結(jié)腸黏膜NF-κB相對活性明顯降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3 討論

UC臨床上主要以腹瀉為主，排出含有血、膿和黏液的糞便，同時常伴有陣發(fā)性結(jié)腸痙攣性疼痛，并里急后重，排便后可獲緩解。本實驗中的大鼠在采用TNBS造模成功后均出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便等癥狀，腸道主要表現(xiàn)為水腫、充血、糜爛，鏡下可見大量中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞浸潤，在病理學(xué)和免疫學(xué)特征上與潰瘍性結(jié)腸炎病患者相似［3-6］。潰瘍性結(jié)腸炎是多種因素、多種機制相互作用的結(jié)果。同時研究還發(fā)現(xiàn)，各種細胞因子能夠相互作用形成復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，加重炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致黏膜損傷，這在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用［6-7］。

表1 大鼠結(jié)腸黏膜核因子-κB DNA結(jié)合活性（x±s）

有研究表明，許多與炎癥和免疫反應(yīng)關(guān)系密切的趨化因子、黏附因子等重要因子均含有κB位點，活化的NF-κB能與特定的κB位點結(jié)合，啟動調(diào)節(jié)參與機體的炎癥和免疫有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，在機體的炎癥、免疫方面發(fā)揮重要作用［9-13］。NF-κB是可跟γ-球蛋白輕鏈基因的增強子GGGACTTTCC（B序列）結(jié)合的一種核蛋白，它在基因表達的先天免疫反應(yīng)、細胞增殖及分化中有重大作用，其中作為誘導(dǎo)UC發(fā)病的促炎因子如腫瘤壞死因子α、白介素6等，已被證實由核因子κB調(diào)節(jié)控制他們的轉(zhuǎn)錄水平，核因子κB的活化可以控制多種促炎因子的基因轉(zhuǎn)錄，這證明它在UC發(fā)病中的作用重大，UC發(fā)病時NF-κB呈過激活狀，放大炎性反應(yīng)［13-18］。

芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》，具有清熱燥濕、調(diào)氣和血的功效。在臨床運用中，針對胃腸濕熱型的UC能取得很好的治療效果。方中黃芩、黃連性味苦寒，入大腸經(jīng)，具有清熱燥濕解毒的功效，以除致病之因，為君藥。方中重用芍藥養(yǎng)血和營、緩急止痛，再配以當(dāng)歸養(yǎng)血活血，體現(xiàn)了“行血則便膿自愈”之義，且可兼顧濕熱邪毒熏灼腸絡(luò)，傷耗陰血之慮；木香、檳榔行氣導(dǎo)滯，“調(diào)氣則后重自除”，四藥相配，調(diào)和氣血，是為臣藥。大黃苦寒沉降，合芩連則清熱燥濕之功著，合歸、芍則活血行氣之力彰，其瀉下通腑作用可通導(dǎo)濕熱積滯從大便而去，體現(xiàn)“通因通用”之法。方以少量肉桂，其辛熱溫通之性，既可助歸、芍行血和營，又可防嘔逆拒藥，屬佐助兼反佐之用。炙甘草和中調(diào)藥，與芍藥相配，又能緩急止痛，亦為佐使。諸藥合用，濕去熱清，氣血調(diào)和，故下痢可愈。

本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)芍藥湯治療過的胃腸濕熱型UC大鼠，其結(jié)腸NF-κB的表達顯著降低，可能是芍藥湯阻斷NF-κB的激活，減少NF-κB的活化誘導(dǎo)因素從而降低了NF-κB p65的表達，起到治療UC的作用。

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Effect of Peony Decoction on DNA binding activity of NF-κB in colonic mucosa of gastrointestinal syndrome with ulcerative colltis rats

LUO Min LI Shuaijun HU Xiangdang WANG Xiaoyan LIN Renjing Y ANG Zhouyu
Department of Anorectal,the Second Affiliated Hospital of Hu'nan University of Chinese Medicine,Hu'nan Province, Changsha 410005,China

ObjectiveTo observe the effect of Peony Decoction Decoction on DNA binding activity of NF-κB in colonic mucosa of gastrointestinal syndrome with ulcerative colltis rats.Methods40 rats were randomly divided into four groups,normal group,model group,Peony Decoction group,SASP group.Gastrointestinal syndrome rat model was prepared,then ulcerative colltis ratmodelwas made by trinitrobenzene-sulfonic acid(TNBS).The rats were killed to getfresh colonic mucosa and extract nuclear proteins after 10 days of treatment.Relative activity of NF-κB was detected by ELISA with a Trans AMTMNF-κB p65 kit.ResultsCompared with normal group［(0.263±0.041)］,the relative activity of NF-κB was significantly higher in modelgroup［(0.467±0.083)］,the difference was statistically significant(P＜0.01);compared with model group,the relative activity of NF-κB was significantly lower in Peony Decoction group［(0.271±0.089)］, the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionPeony Decoction can inhibit the relative activity of NF-κB in colonic mucosa of gastrointestinal syndrome with ulcerative colltis rats.The inhibitory effect of Peony Decoction on ulcerative colltis maybe associate with the inhibition of NF-κB activity.

Peony Decoction;Gastrointestinal syndrome;Ulcerative colitis;Nuclear factor-κB

R574.62；R-332

A

1673-7210(2015）01(c）-0004-03

2014-10-19本文編輯：蘇暢）

湖南省教育廳重點學(xué)科中醫(yī)外科學(xué)項目（編號：湘教發(fā)［2011］76號）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年教師科研基金課題（編號201346）。