黃漢輝 鄭師明 荊冬冬 劉少志 梁穎 關秉恩 嚴鵬科

廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院藥學部，廣東廣州510150

替米沙坦對血管緊張素Ⅱ所致血管內(nèi)皮細胞游離鈣離子的抑制作用

黃漢輝 鄭師明 荊冬冬 劉少志 梁穎 關秉恩 嚴鵬科

廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院藥學部，廣東廣州510150

目的探討血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）對細胞鈣庫的應激效應及替米沙坦對此的拮抗作用。方法預防性實驗分組：正常對照組、AngⅡ0.1μmol/L組和替米沙坦60、300、1000μg/L預處理組；治療性實驗分組：正常對照組、AngⅡ0.1μmol/L組和AngⅡ+替米沙坦60、300、1000μg/L組。分別檢測各組試驗前胞內(nèi)鈣離子濃度，記為0 h。體外培養(yǎng)的人大動脈血管內(nèi)皮細胞預防性給予替米沙坦60、300、1000μg/L培育30 min后，加入AngⅡ0.1μmol/L；或AngⅡ0.1μmol/L培育30 min后，再加入替米沙坦60、300、1000μg/L，分別于共同作用0.5、2、8和24 h采用激光共聚焦掃描顯微鏡成像法檢測胞漿游離鈣離子濃度。結果預防性實驗：與正常對照組相比，替米沙坦60、300、1000μg/L作用細胞30 min對胞漿游離鈣離子濃度無明顯影響，加入AngⅡ0.1μmol/L后，胞漿游離鈣離子濃度立即（0 h）顯著升高，均顯著高于正常對照組（P＜0.05），但顯著低于AngⅡ組，并且替米沙坦預處理濃度越高抑制作用越強（P＜0.05），作用時間對此無影響。治療性實驗：AngⅡ0.1μmol/L先誘導30 min后，再加入替米沙坦60μg/L對升高的胞漿游離鈣離子濃度無抑制作用；替米沙坦300μg/L作用2 h或替米沙坦1000μg/L作用0.5 h才顯示其抑制作用（P＜0.05），但均顯著高于同一時間點的正常對照組。替米沙坦的作用時間對此無影響。結論AngⅡ能誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向胞漿釋放游離鈣離子，而替米沙坦能有效拮抗AngⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激作用及促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重吸收。預防性給予替米沙坦的拮抗作用較治療性給予的拮抗作用顯著。

替米沙坦；血管內(nèi)皮細胞；血管緊張素Ⅱ；鈣離子

高血壓、動脈硬化、冠心病等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均存在著以內(nèi)皮細胞所分泌的一氧化氮（NO）減少而致血管舒張反應下降為主要特征的血管內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙［1］。導致血管內(nèi)皮細胞損傷的因素中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS），尤其是局部RAAS所產(chǎn)生的血管緊張素Ⅱ（angiotensin，AngⅡ）在病理生理方面起著重要的作用［2］。異常升高的AngⅡ可通過與血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的AT1受體結合，引起細胞鈣超載并啟動一系列的細胞凋亡信息轉導過程。替米沙坦（Telmisartan）是新型的長效AngⅡ受體拮抗劑，其作用機制主要是與AT1受體結合，阻斷AngⅡ?qū)T1受體的激動作用，作為臨床一線降壓藥被廣泛應用。以往的研究顯示，替米沙坦對由高糖或AngⅡ等因素所致的血管內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用［3-6］。靜息生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)鈣離子主要儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，使細胞內(nèi)游離鈣離子保持在極低的水平約1×10-7mol/L，細胞內(nèi)外的鈣離子濃度差大約為一萬倍［7］。當遇到相應的刺激時，細胞會通過多種途徑瞬間提高胞內(nèi)局部或全部的鈣離子濃度。其中主要的途徑包括胞外鈣離子的內(nèi)流和胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激釋放儲存在其的鈣離子。細胞內(nèi)鈣離子濃度在細胞死亡過程中有變化，并且這種變化與許多病理狀態(tài)相關。已有的研究報道中，在探討替米沙坦對內(nèi)皮細胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度影響時，較少區(qū)分引起胞內(nèi)鈣離子濃度變化的途徑或給予限制，本文通過采用無鈣離子細胞培養(yǎng)基，消除細胞應激后鈣離子從胞外內(nèi)流的途徑，探討AngⅡ刺激后胞內(nèi)鈣離子的變化，觀察替米沙坦對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源游離鈣離子濃度的調(diào)控作用，以細化這兩類物質(zhì)（藥物）對胞內(nèi)鈣離子影響及其誘發(fā)細胞凋亡的基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人大動脈血管內(nèi)皮細胞株（VEC），PriCell公司；替米沙坦，森瑞化工有限公司；AngⅡ，Sigma公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；無鈣DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；Fluo-3/AM，Sigma公司。替米沙坦和AngⅡ均用無鈣無血清DMEM培養(yǎng)液溶解配成10 mg/L和2μmol/L母液，用時以無鈣無血清DMEM細胞培養(yǎng)液調(diào)節(jié)終末濃度。

1.2 細胞培養(yǎng)

常規(guī)復蘇血管內(nèi)皮細胞株，以含血清DMEM培養(yǎng)基（90%高糖DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清）制備濃度為1×105/mL的血管內(nèi)皮細胞懸浮液。取10 mL血管內(nèi)皮細胞懸浮液置于75 cm2無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，在5% CO2、37℃、濕度95%的條件中孵化培養(yǎng)，隔天置換培養(yǎng)液。當內(nèi)皮細胞長至80%～90%融合時，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合液消化傳代。當細胞傳至第3代時，將細胞接種于35 mm激光共聚焦玻璃底細胞培養(yǎng)皿中，細胞密度為5×104個/mL，置回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿后進入分組、Fluo-3/AM負載及干預試驗程序。

1.3 實驗分組及處理

根據(jù)健康人體口服40、80、120 mg替米沙坦片測得的血漿藥物峰濃度（Cmax）［8］，實驗藥物濃度設計為60、300、1000μg/L。

1.3.1 預防性實驗將接種于35 mm細胞培養(yǎng)皿中的血管內(nèi)皮細胞分為5組：正常對照組、替米沙坦60、300、1000μg/L預處理組和AngⅡ0.1μmol/L組。試驗添加藥物前每組分別測定初始鈣離子濃度（0 h），設為T0。隨后，各組培養(yǎng)基中分別加入培養(yǎng)液10μL（正常對照組）、濃度為0.036 g/L的替米沙坦10μL（60μg/L替米沙坦組）、濃度為0.18 g/L的替米沙坦10μL（300μg/L替米沙坦組）、濃度0.60 g/L的替米沙坦10μL（1000μg/L替米沙坦組）和培養(yǎng)液10μL（AngⅡ0.1μmol/L組）。替米沙坦預處理30 min后檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度（T1），除正常對照組外，其余組均加入濃度2μmol/L的AngⅡ10μL，并分別繼續(xù)共同培養(yǎng)，于AngⅡ加入后瞬時（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽樣檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

1.3.2 治療性實驗將接種于35 mm細胞培養(yǎng)皿中的血管內(nèi)皮細胞分為5組：正常對照組、AngⅡ0.1μmol/L組，AngⅡ+替米沙坦60、300、1000μg/L組。試驗添加藥物前每組分別測定初始鈣離子濃度（0 h），設為T0。隨后，除正常對照組外，其余各組加入0.1μmol/L的AngⅡ10μL培養(yǎng)30 min后檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度（T1），再加入替米沙坦（加入濃度和體積同“1.3.1”項下），并分別繼續(xù)共同培養(yǎng)，于替米沙坦加入后瞬時（T2）、0.5 h（T3）、2 h（T4）、8 h（T5）和24 h（T6）抽樣檢測細胞內(nèi)游離鈣離子濃度。

1.4 胞漿游離鈣離子濃度測定[9]

按照檢測時間，分別取各組細胞應用激光共聚焦掃描顯微鏡調(diào)節(jié)激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為526 nm，置負載Fluo-3的內(nèi)皮細胞于鏡下，于每個檢測時點，每組隨機選取活細胞8個，各細胞共掃描16次，每次掃描間隔時間為2 s，取16次掃描測得的平均熒光強度數(shù)值作為該內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣離子濃度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 替米沙坦預處理對AngⅡ?qū)е碌难軆?nèi)皮細胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

替米沙坦預處理加入AngⅡ0.1μmol/L后，胞漿游離鈣離子濃度立即（0 h）顯著升高，均顯著高于正常對照組（P＜0.05），但顯著低于AngⅡ組，并且替米沙坦預處理濃度越高抑制作用越強（P＜0.05），作用時間對此無影響。見表1。

2.2 替米沙坦對AngⅡ?qū)е碌难軆?nèi)皮細胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響

與正常對照組相比，AngⅡ0.1μmol/L誘導30 min，鈣離子濃度顯著升高（P＜0.05）。與AngⅡ0.1μmol/L相比，加入替米沙坦60μg/L作用24 h，對升高的胞漿游離鈣離子濃度無抑制作用；替米沙坦300μg/L作用2 h或替米沙坦1000μg/L作用0.5 h才顯示其抑制作用（P＜0.05），均顯著高于同一時間點的正常對照組；替米沙坦的作用時間對此無影響。見表2。

3 討論

本試驗結果顯示，AngⅡ能誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫向胞漿釋放游離鈣離子，而替米沙坦具有效拮抗AngⅡ?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激作用及促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重吸收。血管內(nèi)皮細胞具有物質(zhì)轉運、自分泌、旁分泌等多重功能，是易受損的功能性界面，對各種不同的病理生理干預均可發(fā)生形態(tài)學和生物化學方面的改變。多種心血管病變均可引起內(nèi)源性AngⅡ分泌增加，超生理濃度的AngⅡ可通過與血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的AT1受體結合，激動G蛋白，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇水解生成三磷酸肌醇（IP3），生成的IP3激動細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體（IP3敏感型鈣庫），致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞漿釋放大量游離Ca2+，同時損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵（endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）的活力，影響其對細胞質(zhì)游離鈣離子的重新吸收，引起細胞鈣超載并啟動一系列的細胞凋亡信息轉導過程［10-12］，這一系列的改變將進一步引起細胞骨架降解，導致細胞出現(xiàn)自溶反應［13-15］。而血管內(nèi)皮細胞凋亡是動脈粥樣硬化病變的獨立危險因素［1］。

表1 替米沙坦預防性實驗對鈣離子熒光強度的影響（x±s）

表2 替米沙坦治療性實驗對鈣離子熒光強度的影響（x±s）

替米沙坦是新型的AngⅡ受體拮抗劑，其作用機制主要是與AT1受體結合，阻斷AngⅡ?qū)T1受體的激動作用。Selman等［11］對心肌細胞的研究中觀察到，替米沙坦能在一定程度上阻斷IP3對IP3受體的激動作用，并在進一步的動物試驗中觀察到，長期給高血壓大鼠灌服替米沙坦可令IP3受體的數(shù)量下調(diào)。Abiko等［10］等Maczewski等［14］研究表明，AngⅡ、甲狀腺素等作用內(nèi)皮細胞后，SERCA mRNA和蛋白質(zhì)的表達顯著下降且和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+的能力下降相關，咪達普利和替米沙坦干預后，SERCA mRNA表達無明顯變化，但可顯著提高SERCA的活力。

從本試驗的預防性和治療性試驗觀察到，血管內(nèi)皮細胞經(jīng)替米沙坦預處理30 min后均能有效拮抗AngⅡ引起的胞漿游離鈣離子濃度上升。這可能與替米沙坦為AngⅡ受體拮抗劑，經(jīng)替米沙坦預處理30 min后，藥物優(yōu)先占據(jù)AngⅡ的AT1受體結合位點，阻礙或（和）減弱了AngⅡ?qū)Y合位點的激動作用及由于受體激動后所誘發(fā)的連鎖反應。替米沙坦的預防作用也可能與其阻斷IP3對IP3受體的激動作用，部分阻斷鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放有關。

AngⅡ預先誘導30 min的試驗中，300μg/L替米沙坦作用2 h或1000μg/L替米沙坦作用0.5 h才顯示其抑制胞漿游離鈣離子濃度的作用。這可能由于AT1受體被AngⅡ預先占據(jù)并激動，而AngⅡ在細胞和組織中的半衰期為15～30 min，在此期間AT1受體等結合位點依然被AngⅡ所占據(jù)但由于替米沙坦與AngⅡ競爭相同的作用位點。因此，替米沙坦同樣起到一定的拮抗作用，以至于抑制了胞內(nèi)游離Ca2+的持續(xù)上升（與AngⅡ模型組比較）。隨著AngⅡ被活細胞逐漸代謝，原先被AngⅡ占據(jù)的結合位點重新暴露并被替米沙坦占據(jù)。其后胞內(nèi)游離鈣離子濃度的降低可能與沙坦類藥物同時抑制多種細胞內(nèi)氧化反應［16-21］，或替米沙坦提高了SERCA的活力，促使胞漿游離鈣離子重新被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器重吸收有關。

從觀察到的結果可以得出，替米沙坦對AngⅡ引起的胞漿游離鈣離子濃度的上升拮抗作用具有劑量相關性，高濃度的替米沙坦拮抗作用明顯優(yōu)于低濃度。但基于受體具有飽和性，組織或細胞中含有某種受體的數(shù)目是相對固定的，當受體與配體結合達到飽和時，生物效應并不會因為配體數(shù)目的增加而又有增強。故此，替米沙坦或許存在拮抗AngⅡ受體外的其他保護血管內(nèi)皮細胞的作用機制，如阻斷鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放、提高SERCA的活力加快胞內(nèi)游離鈣離子的重吸收等，以終止和（或）延緩細胞凋亡的進程。

綜上所述，替米沙坦可通過影響AT1受體、IP3受體及SERCA的活力等保護降低內(nèi)皮細胞內(nèi)游離鈣離子水平，減少細胞鈣超載，進而逆轉內(nèi)皮細胞凋亡。

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The inhibitory effect of Telmisartan on vascular endothelium cells free calcium induced by angiotensinⅡ

HUANG Hanhui ZHENG Shiming JING Dongdong LIU Shaozhi LIANG Ying GUAN Bing'en YAN Pengke
Department of Pharmacy,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province, Guangzhou 510150,China

ObjectiveTo explore the effect of angiotensin(Ang)Ⅱon intracellular free calcium concentration in vascular endothelial cell(VEC)and antagonism of Telmisartan.MethodsPreventive test:control group;AngⅡ0.1μmol/L group;60,300 and 1000μg/L Telmisartan groups.Therapeutic test:control group;AngⅡ0.1μmol/L group;60,300 and 1000μg/L Telmisartan+AngⅡgroups.Intracellular calcium concentration was detected in each groups before the tests and the time were denoted 0 h.VECs co-cultured with 60,300 and 1000μg/L Telmisartan separately as prevention and increased AngⅡ0.1μmol/L after 30 min;or VECs co-cultured with AngⅡ0.1μmol/L and increased 60, 300 and 1000μg/L Telmisartan separately after 30 min.Then,concentration of intracellular free calcium concentration in VEC was scanned by laser scanning confocal microscope on certain point time when VECs were co-cultured 0.5,2, 8 and 24 h.ResultsPreventive test:compared with the control group,VECs pre-co-cultured with 60,300 and 1000 μg/L Telmisartan 30 min separately has no discernible effect on VEC's intracellular free calcium concentration.But after increasing AngⅡ0.1μmol/L,concentration of intracellular free calcium climbed significantly instantaneously, which were higher than control group(P＜0.05),but lower than the groups which never pretreated with Telmisartan and preformed dose-response relationship characters. Therapeutic test:VECs were pretreated with AngⅡ0.1 μmol/L showed Telmisartan preformed resistance after 2 h with 300μg/L and 0.5 h with 1000μg/L(P＜0.05).But 60μg/L Telmisartan had no discernible effect on VEC'sintracellular free calcium concentration.In both experiment,time have no much effect on the results.Conclusion AngⅡcan induce endoplasmic reticulum calcium store release free calcium to the cytoplasmic.Telmisartan can antagonize the stress effect on endoplasmic reticulum caused by AngⅡand promote the intracellular free calcium ion re-reabsorption by the endoplasmic reticulum.Effects of resistance of Telmisartan on pretreatment as prevention is higher than those on treatment as therapy.

Telmisartan;Vascular endothelial cell;AngiotensinⅡ;Ca2+

R972.4

A

1673-7210(2015）01(c）-0011-05

2014-10-28本文編輯：程銘）

黃漢輝（1975-），男，副主任藥師；研究方向：心腦血管疾病的發(fā)病機制。

嚴鵬科（1967-），男，醫(yī)學博士，主任藥師，教授，碩士生導師；研究方向：心腦血管疾病的發(fā)病機制和新藥研發(fā)。