王振強(qiáng)，李孝坤，王 浩*

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南 開(kāi)封 475003；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取番茄皮渣中番茄紅素工藝及其HPLC-MS測(cè)定

王振強(qiáng)1，李孝坤1，王 浩2,*

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系，河南 開(kāi)封 475003；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

以番茄皮渣為原料，采用超聲輔助提取工藝，研究提取溶劑種類、超聲功率、液固比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)番茄紅素提取效果的影響，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)分析，確定最佳工藝條件為：皮渣經(jīng)95%乙醇溶液處理后，以乙酸乙酯為提取溶劑，提取溫度50℃、提取時(shí)間45 min、液固比5∶1（mL/g）、超聲功率270 W。產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定，番茄紅素提取量可達(dá)到250.1 mg/kg。通過(guò)組織結(jié)構(gòu)觀察，與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲提取能有效破壞植物組織結(jié)構(gòu)，提高提取效果。

番茄紅素；番茄皮渣；超聲輔助提取；優(yōu)化；測(cè)定

番茄紅素是一種脂溶性天然色素，由11個(gè)共軛及2個(gè)非共軛碳-碳雙鍵組成，具有抗氧化、抑制癌細(xì)胞增殖、抑制低密度蛋白氧化等生理功能[1-2]、廣泛用于保健食品、藥品、化妝品領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)番茄紅素的提取主要以番茄[3-5]或番茄醬[6]為原料，采用回流浸提[7-8]和微波輔助提取[9]，提取成本較高。超聲提取法利用超聲波所產(chǎn)生的超聲能、強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)等作用，從而縮短提取時(shí)間，提高提取效率[10-12]，已成為現(xiàn)代天然產(chǎn)物活性成分分離提取研究領(lǐng)域的新技術(shù)、新方法之一。

我國(guó)是番茄生產(chǎn)大國(guó)，在番茄制品的工業(yè)化生產(chǎn)中剝離的蠟質(zhì)表皮常帶有部分表層果肉，此部分稱為番茄皮渣，常被廢棄。研究[13-14]表明與表皮相連部分果肉中番茄紅素的含量較果實(shí)其他部位要高的多，因此，為充分利用資源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)從番茄皮渣中提取番茄紅素的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

番茄皮渣 新疆萬(wàn)選千挑農(nóng)產(chǎn)有限公司；番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%） 美國(guó)Sigma公司；乙醇 天津四通化工廠；6#溶劑油 洛陽(yáng)市奧達(dá)化工有限公司；石油醚、正己烷、丙酮、乙酸乙酯均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

KQ-300E超聲槽 昆山超聲波清洗器有限公司；LCQ高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用儀美國(guó)Thermo公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

番茄皮渣→水洗（去籽）→乙醇預(yù)處理→超聲輔助提取→離心→減壓濃縮→番茄紅素油樹(shù)脂

1.3.2提取溶劑的選擇

選取石油醚、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、6#溶劑油5種試劑作為提取溶劑[15]。稱取95%乙醇溶液預(yù)處理的番茄皮渣5.0 g，按照液固比6∶1（mL/g）加入上述溶劑，提取溫度50℃、超聲功率300 W、提取時(shí)間50 min，離心、減壓濃縮，HPLC測(cè)定番茄紅素提取量。

1.3.3提取溫度的選擇

稱取95%乙醇溶液預(yù)處理的番茄皮渣5.0 g，按照液固比6∶1（mL/g）加入乙酸乙酯，超聲功率300 W，分別在30、40、50、60、70℃條件下提取50 min，離心、減壓濃縮，HPLC測(cè)定番茄紅素提取量。

1.3.4液固比的選擇

稱取95%乙醇溶液預(yù)處理的番茄皮渣5.0 g，提取溫度50℃、超聲功率300 W，分別按照液固比3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）加入乙酸乙酯，提取50 min，離心、減壓濃縮，HPLC測(cè)定番茄紅素提取量。

1.3.5提取時(shí)間的選擇

稱取95%乙醇溶液預(yù)處理的番茄皮渣5.0 g，按照液固比5∶1（mL/g）加入乙酸乙酯，提取溫度50℃、超聲功率300 W，提取時(shí)間分別為25、35、45、55、65 min，離心、減壓濃縮，HPLC測(cè)定番茄紅素提取量。

1.3.6超聲功率的選擇

稱取95%乙醇溶液預(yù)處理的番茄皮渣5.0 g，按照液固比5∶1（mL/g）加入乙酸乙酯，提取溫度50℃，分別在超聲功率180、210、240、270、300 W條件下提取45 min，離心、減壓濃縮，HPLC測(cè)定番茄紅素提取量。

1.3.7超聲輔助提取工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取溫度、液固比、提取時(shí)間、超聲功率為試驗(yàn)因素，以番茄紅素提取量為指標(biāo)，利響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，數(shù)據(jù)采用SAS 8.0軟件處理。

1.3.8番茄紅素的HPLC測(cè)定

1.3.8.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg，二氯甲烷定容于100 mL棕色容量瓶，配成番茄紅素質(zhì)量濃度為3 8 ?g/m L的標(biāo)準(zhǔn)液。色譜條件為C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相為V（二氯甲烷）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=0.25∶1∶1；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)472 nm；進(jìn)樣量20 ?L。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作圖，得番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.8.2樣品中番茄紅素含量測(cè)定

取適量樣品用二氯甲烷定容于25 mL棕色容量瓶，按色譜條件分析，計(jì)算番茄紅素含量[16]。

1.3.8.3番茄紅素提取量的計(jì)算

1.3.9番茄紅素的MS測(cè)定

采用電噴霧離子源，正離子檢測(cè)，全離子掃描范圍100～500 nm，歸一化碰撞能量35%，毛細(xì)管電壓-10.0 V，毛細(xì)管溫度275 ℃，電噴霧電壓4.5 kV，鞘氣（N2）流速30 arb、輔助氣（N2）流速5 arb，套管透鏡補(bǔ)償電壓-50.0 V。

2 結(jié)果與分析

2.1提取溶劑種類的確定

石油醚、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、6#溶劑油5種試劑作為常用的提取溶劑，對(duì)番茄紅素的提取效果如圖1所示。

圖1 提取溶劑種類對(duì)提取量的影響Fig.1 Effect of solvents on the extraction yield of lycopene

由圖1可知，乙酸乙酯提取番茄紅素提取量為251.2 mg/kg，提取效果明顯優(yōu)于石油醚和6#溶劑油，此外，考慮正己烷和丙酮的價(jià)格及安全性等因素，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取溫度的確定

由圖2可知，提取溫度的升高有利于番茄紅素的有效溶出，隨著溫度的升高，提取量相應(yīng)升高；當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，提取量最大，之后溫度升高而提取量緩慢降低，可能是由于溫度升高導(dǎo)致番茄紅素穩(wěn)定性降低。因此，提取溫度為50 ℃較適于番茄紅素的提取[17]。

圖2 提取溫度對(duì)提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of lycopene

2.2.2液固比的確定

圖3 液固比對(duì)提取量的影響Fig.3 Effect of ratio of solvent to solid on the extraction yield of lycopene

由圖3可知，液固比為5∶1（mL/g）時(shí)，番茄紅素提取量較高，此后加大溶劑用量，提取效果增加不顯著；考慮實(shí)際生產(chǎn)中溶劑回收損耗、能耗消耗等因素，選擇液固比為5∶1（mL/g）[18]。

2.2.3提取時(shí)間的確定

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield of lycopene

由圖4可知，提取時(shí)間的延長(zhǎng)有利于番茄紅素的有效溶出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量相應(yīng)升高[19]。當(dāng)提取時(shí)間為45 min時(shí)，提取量達(dá)到最大，之后延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取量緩慢下降，提取時(shí)間為45 min較合適于番茄紅素的提取。

2.2.4超聲功率的確定

圖5 超聲功率對(duì)提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of lycopene

由圖5可知，超聲提取過(guò)程中產(chǎn)生的超聲能、強(qiáng)烈機(jī)械振動(dòng)和空化效應(yīng)等作用有利于番茄紅素的提取[20]，隨著超聲功率的增大，提取量逐漸提高，超聲提取功率為270 W時(shí)，番茄紅素的提取量達(dá)到最大，之后增大超聲功率提取效果增加不顯著，因此，超聲功率選擇270 W較合適于番茄紅素的提取。

2.3工藝參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以番茄紅素提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Experimental designs and results for response surface analysis

以番茄紅素提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用SAS程序進(jìn)行分析，經(jīng)回歸擬合后，得到番茄紅素提取量預(yù)測(cè)值（Y）對(duì)編碼自變量X1、X2、X3和X4的回歸方程：

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

用SAS程序?qū)?7個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，得回歸方程方差分析如表2所示：回歸方程描述各因子與響應(yīng)值關(guān)系時(shí)，其因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著，模型的確定系數(shù)R2=97.3%，說(shuō)明回歸方程擬合度較好，可用此模型對(duì)番茄紅素的提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表2回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：模型一次項(xiàng)X1極顯著；二次項(xiàng)極其顯著，均處于顯著水平。

2.4響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，分析提取溫度、液固比、提取時(shí)間、超聲功率對(duì)番茄紅素提取量的影響，響應(yīng)面等高線分析如圖6所示。

圖6 超聲輔助提取試驗(yàn)等高線圖Fig.6 Contours showing the effect of UAE parameters on the extraction yield of lycopene

由圖6可知，提取溫度在40～51 ℃范圍內(nèi)，提取溫度的升高有利于番茄紅素的提取，此后提高溫度提取量呈下降趨勢(shì)；液固比在4∶1～6∶1（mL/g）范圍內(nèi)，溶劑用量的增加有利于番茄紅素的溶出，提取量逐漸增加；提取時(shí)間在33～45 min范圍內(nèi)，提取量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而提高；番茄紅素提取量隨超聲功率的增加先增加，達(dá)到一定值后，呈逐漸下降的趨勢(shì)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果綜合分析，超聲作用下番茄紅素提取的最佳工藝條件為：提取溫度50 ℃、提取時(shí)間45 min、液固比5∶1（mL/g）、超聲功率270 W。在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提取量為250.1 mg/kg，和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果理論值249.0 mg/kg基本一致。

2.5不同提取方法工藝條件比較

不同提取方法工藝條件比較見(jiàn)表3，番茄皮渣經(jīng)不同提取方法處理后用顯微鏡觀察組織形態(tài)如圖7所示。

表3 不同提取方法提取效果比較Table 3 Comparison of extraction efficiency between UAE method and the conventional solvent extraction

圖7 番茄皮渣組織形態(tài)圖（×1 000）Fig.7 Micrographs of tomato peel（×1 000）

采用乙醇預(yù)處理有利于番茄紅素的提取，超聲輔助提取較熱回流提取，可大大縮短提取時(shí)間，避免因提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成的番茄紅素氧化損失[21]。由圖7番茄皮渣經(jīng)乙醇、超聲處理前后的組織形態(tài)圖可知，未經(jīng)處理的番茄皮渣細(xì)胞為圓形，細(xì)胞壁較厚，顏色較深，經(jīng)乙醇處理后細(xì)胞壁變薄；熱回流提取后細(xì)胞形狀不規(guī)則，壁上有許多破損且細(xì)胞間隙明顯增大；經(jīng)超聲波提取過(guò)后細(xì)胞上遍布微孔，細(xì)胞間隙更加明顯[22]。這些宏觀表癥與各工藝提取作用的機(jī)理密切相關(guān)，乙醇處理有助于番茄紅素的溶出，超聲波輔助提取較熱回流提取能更有效地破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞壁的通透性，從而使有效成分得以快速釋放溶出，加速番茄紅素的提取[23]。

2.6番茄紅素含量的HPLC-MS分析

番茄紅素HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=187.64x-2.364 6，R2=0.998 6，在1.5～76.0 ?g/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系[24]。番茄紅素標(biāo)品與提取產(chǎn)物的HPLC測(cè)定結(jié)果如圖8所示。

圖8 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（a）與番茄紅素提取物（b）的液相色譜圖Fig.8 HPLC profiles of lycopene standard (a) and lycopene extracted from tomato peel (b)

經(jīng)HPLC-MS分析，提取物質(zhì)譜分析結(jié)果如圖9所示，提取物m/z為536.15，與番茄紅素的相對(duì)分子質(zhì)量536.88一致[25]，由此可斷定提取物為番茄紅素。

圖9 番茄紅素提取物質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectrum of lycopene extract

3 結(jié) 論

超聲輔助提取番茄皮渣中番茄紅素的最優(yōu)工藝條件為：95%乙醇對(duì)番茄皮預(yù)處理后，以乙酸乙酯為提取溶劑，提取溫度50 ℃、提取時(shí)間45 min、液固比5∶1（mL/g）、超聲功率270 W。番茄紅素提取量可達(dá)到250.1 mg/kg。采用超聲輔助提取，超聲能量可有效破壞組織結(jié)構(gòu)，加速番茄紅素溶出，縮短提取時(shí)間，提高提取效率。

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Lycopene from Tomato Peel: Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction by Response Surface Methodology and Identification by High Performance Liquid Chromatography

WANG Zhenqiang1, LI Xiaokun1, WANG Hao2,*

(1. Department of Environmental and Chemical Engineering, Yellow River Conservancy Technical Institute, Kaifeng 475003, China; 2. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, School of Food Engineering and Biological Technology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)

The extraction of lycopene from tomato peal by ultrasonic-assisted extraction (UAE) was studied. To obtain the optimal conditions, the effects of operating conditions such as solvent to solid ratio, ultrasonic power, extraction time and temperature on the extraction yield of lycopene were studied through response surface methodology. The best extraction conditions were determined as follows: pretreatment with 95%ethanol, ethyl acetate as extraction solvent, extraction temperature 50℃, extraction time 45 min, a solvent to solid ratio of 5:1 (mL/g) and ultrasonic power 270 W. Under these conditions 250.1 mg of lycopene was obtained from 1 kg of tomato peal by UAE. The lycopene compositions of extracts were identified by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). Compared with the conventional solvent extraction, UAE was more efficient and rapid to extract lycopene from tomato peel, due to the strong disruption of the structure of peel tissue under ultrasonic irradiation, as observed by microscopy.

lycopene; tomato peal; ultrasonic-assisted extraction (UAE); optimization; identification

TS202.3

A

1002-6630（2015）12-0070-06

10.7506/spkx1002-6630-201512013

2015-01-06

王振強(qiáng)（1979—），男，講師，碩士，主要從事食品檢測(cè)分析教學(xué)與研究。E-mail：wangzhenqiang_42@163.com

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與安全教學(xué)與研究。E-mail：46654859@qq.com